Nat Bio:新单细胞mRNA测序揭示大脑皮层细胞发育的独特性

  加州大学旧金山分校的研究人员利用新的单细胞分析方法研究大脑皮层细胞的独特性，识别不同细胞类型的数百个新型生物标志物，这一项成果将提高科学家们对于出现特化神经元亚型的理解。这种集中于单细胞基因活性的新方法，最终与其他单细胞技术(包括显微成像)相结合，可能会揭示脑部发育障碍的起源。相关文章发表于2014年8月3日的《Nature Biotechnology》杂志上。

  单细胞基因表达的大规模分析，有可能发现罕见的细胞群和血统关系，但是需要有效的方法进行细胞捕获和mRNA测序。尽管细胞条形码策略允许超低深度的单细胞平行测序，但是测序深度较浅的限制还需要进一步的研究解决。

  目前，加州大学旧金山分校(UCSF)的研究人员尝试了一种新的策略。利用一个特殊的“微流体”设备，他们把单个细胞捕获，然后将其导入纳升级的小室中。这些小室可以精确的控制DNA测序所需的各步扩增反应。研究表明，如果要达到确定细胞类型的目的，实际所需的用于拼接的测序阅读数仅是预计的1/100；这项技术是由Fluidigm公司开发，可同时用于96个细胞的独立分析。

  UCSF Eli and Edythe Broad 再生医学和干细胞研究中心主任Arnold Kriegstein博士和Kriegstein实验室博士后Tomasz Nowakowski一起，进行了关键的实验，在实验中，他们分析了来自大脑发育过程中301个细胞的基因活化。

  Kriegstein称，识别不同细胞类型的数百个新型生物标志物，将提高科学家们对于出现特化神经元亚型的理解。最终，这种集中于单细胞基因活性的新方法，与其他单细胞技术(包括显微成像)相结合，可能会揭示脑部发育障碍的起源。

  Kriegstein指出，这个过程可以揭示一些脑部疾病，包括平脑症，这种疾病患者大脑皮层中的褶皱无法发育，而且疾病在发育后期才被诊断，如自闭症和精神分裂症。

  根据这篇论文作者的介绍，这种分析单细胞中分子的策略，不仅有利于研究特化细胞如何出现在发育有机体的特定时间和地点，也有利于监测干细胞(设计用于组织置换)的细胞特性，以及调查肿瘤内细胞多样性以确定癌细胞存活和传播的原因。

  任何未经处理的生物样品，无论多么纯，其中都含有各种各样代表不同组织类型的细胞。研究人员已经测定了这些样品中的结合遗传物质。为了研究哪些基因是活跃的，哪些是休眠的，他们使用测序步骤的无理性重复，来捕捉足够数量的信使RNA序列，这些序列转录自交换基因。然而，很难从混合组织样品中推断，哪些基因是由特定的细胞类型表达的。

  Pollen和Nowakowski表明，通过单细胞分析区别不同的细胞类型，需要的步骤、时间和金钱，比以前认为的更少。

  Pollen说：“我们正在研究大脑中不同、但相关的细胞类型的一个生态系统。我们正在将这个群落分成不同的细胞群体，旨在了解它们的功能部件和组件，这样我们就能精确地预测它们将如何发育。”

  本文共同作者、Fluidigm 公司资深科学家Joe Shuga博士称，该公司开发的用以捕获和为信使RNA测序准备细胞的系统，可以产生更准确的序列数据。
（转化医学网360zhyx.com）

  原文摘要：

  Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex

  Alex A Pollen, Tomasz J Nowakowski, Joe Shuga, Xiaohui Wang, Anne A Leyrat, Jan H Lui,Nianzhen Li, Lukasz Szpankowski, Brian Fowler, Peilin Chen, Naveen Ramalingam, Gang Sun, Myo Thu, Michael Norris, Ronald Lebofsky, Dominique Toppani, Darnell W Kemp II,Michael Wong, Barry Clerkson, Brittnee N Jones, Shiquan Wu, Lawrence Knutsson,Beatriz Alvarado, Jing Wang, Lesley S Weaver et al.

  Large-scale surveys of single-cell gene expression have the potential to reveal rare cell populations and lineage relationships but require efficient methods for cell capture and mRNA sequencing. Although cellular barcoding strategies allow parallel sequencing of single cells at ultra-low depths, the limitations of shallow sequencing have not been investigated directly. By capturing 301 single cells from 11 populations using microfluidics and analyzing single-cell transcriptomes across downsampled sequencing depths, we demonstrate that shallow single-cell mRNA sequencing (~50,000 reads per cell) is sufficient for unbiased cell-type classification and biomarker identification. In the developing cortex, we identify diverse cell types, including multiple progenitor and neuronal subtypes, and we identify EGR1 and FOS as previously unreported candidate targets of Notch signaling in human but not mouse radial glia. Our strategy establishes an efficient method for unbiased analysis and comparison of cell populations from heterogeneous tissue by microfluidic single-cell capture and low-coverage sequencing of many cells.