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多项新技术助力唾液生物标记研究

首页 » 研究 » 检验 2015-07-10 生物通 赞(2)
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导读
唾液中含有多种可以快速降解你目标物的酶,一些目标分子,如皮质醇或褪黑激素在室温下要比其它成分更为稳定,但是一般情况下,最好还是在样品收集后立刻放到冰箱中冷藏,同时在冷冻起来之前也需要进行纯化。

健康成人三个主要腺体每天大约要分泌1至1.5升的唾液,这些唾液中大部分是水,其它成分还包括电解质和蛋白质,例如形成粘液,分解食物和细菌的酶,以及分泌抗体所需的糖蛋白等。

虽然唾液相对于血液来说,更加容易收集,存储和运输,也更便宜,但是相关的流体研究和新型唾液,口腔诊断技术却并不方便和简单。因此设计相关的实验需要考虑已商业化可用的工具,合适的流程,稳定性,以及出现问题的策略。这些因素都会影响你的结果,尤其是如果你希望能定量分析的话。近期The Scientist杂志就总结了几位唾液研究专家,分享他们的秘诀。

分析对象是什么

DNA

唾液研究最活跃的领域之一就是从中寻找上皮细胞和白细胞的DNA进行分析,目前不少科学家们正在唾液中寻找与囊肿性纤维化(囊性纤维化)、自闭症和其他疾病相关的基因。像是Oasis Diagnostics公司就已经验证了其设备DNA•SAL 能用于多种遗传疾病和患病风险的检测,其中包括戈谢氏病、地中海贫血症和心血管疾病等。

其它也有不少公司除了提供样品收集工具,也提供保存唾液样品的提取试剂盒,此前发表在Journal of Visualized Experiments上的一个操作手册就详细介绍了从唾液中提取DNA,用于新一代测序技术分析的全过程。(原文标题:Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing)

此外,尽管唾液成分各有不同,但是大约30%唾液口水中的DNA来自于口腔中的细菌。NEB公司有一种细菌DNA富集提取试剂盒:NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit,采用一种新方法将微生物DNA与宿主DNA分离,降低测序成本。

RNA

利用RNA能检测到除了口腔疾病之外的疾病,来自加州大学洛杉矶分校的David Wong等人发现唾液中的某些RNAs与口腔以及其它癌症发生有关,文章标题为:Salivary microRNAs and oral cancer detection,采用的方法是绘制唾液miRNAs图谱,同时这篇文章也介绍了一种样品收集工具(可收集核酸和蛋白),即RNAPro•SAL。此外还有其他一些研究人员研发了从唾液细胞中分离RNA的方法(High-Yield RNA-Extraction Method for Saliva)。

唾液中大部分RNA也是来自于口腔中的细菌,Wong研究组的一项成果指出增加一步低速离心,能提高测序的深度,减少细菌RNA的干扰(The Human Salivary RNA Transcriptome Revealed by Massively Parallel Sequencing)。多肽和蛋白质

约30%在血液中发现的蛋白也会出现在唾液中,具体包括细胞因子、激素、生长因子和抗体等。研究人员也正在评估唾液蛋白作为潜在炎症、阿尔茨海默氏症和糖尿病的可能性。从技术上值得注意的是,蛋白也与RNA一样,容易受到酶的攻击,因此需要不同的收集方法。

如何收集

总体来说唾液收集没有统一的方法,这要考虑到参与实验人员的年龄,以及即将进行何种实验。而这种收集方式,以及样品在口腔中位置和收集时间会造成影响。

不同唾液分析物收集的一个金标准就是Passive drool,即实验参与者让口腔中的唾液自然汇集,然后身体前倾,让其流入一个试管中,但是这对于一些患者来说并不容易。

当研究人员的研究对象是早产儿和新生儿的时候,那么就需要婴儿的一个最常见的动作:吸吮,不过现在临床研究人员研发了一种Pedia•SAL新工具,这种设备能与安抚奶嘴连接在一起,帮助收集婴儿唾液。

还有一些工具也能通过吸取唾液进行收集,关键在于找到一个适合你目标分子的工具,“我们都知道如果用泡沫或棉花吸收唾液样本,有可能会以我们不知道的方式改变样品的完整性。因此根据你的目标分子来决定样品是否能用,”亚利桑那州大学跨学科唾液生物科学研究所所长Douglas Granger说,他同时也是Salimetrics 的创始人。

如何提高收集量

通过passive drool方法能获得足够量的样品,但是如果你需要刺激唾液分泌,那怎么办呢?

今年的一项肉食性摄入研究表明,微博熏肉的香味能促进唾液流量,同时也不会干扰激素浓度。(New Techniques for Augmenting Saliva Collection: Bacon Rules and Lozenge Drools)

除此之外,还有止咳糖、漱口水和口香糖都可以刺激唾液流量。当然首先需要确定这些刺激方法不会干扰目标物的检测,比如漱口水有可能会冲淡你的样品,Malamud说。

他也警告说,“非刺激唾液是通过吐到杯子中,还是通过像我们这样的刺激工具进行收集,也会影响结果,”改变唾液量有可能会改变某些分析物的浓度。除了刺激唾液量,还有许多因素会影响唾液的分泌速度,如年龄、运动、吸烟习惯、饮酒、时间和整体口腔健康等,个人唾液分泌速度也是定量研究必不可少的数据,一些研究人员会直接检测个人分泌速度:收集唾液量除以所花的时间。

另外一种方法就是采用新设备,来自加州大学洛杉矶分校的Vivek Shetty与他的同事就开发了这样的一种装置,目前可以通过日本Nanbu Irika公司购买这种设备,每个约为10美元(当地价格),30个280美元。

如何保存样品

唾液中含有多种可以快速降解你目标物的酶,一些目标分子,如皮质醇或褪黑激素在室温下要比其它成分更为稳定,但是一般情况下,最好还是在样品收集后立刻放到冰箱中冷藏,同时在冷冻起来之前也需要进行纯化。Slowey说。

纯化方式一部分取决于你的目标分子是在细胞内还是细胞外,这两个存在方式目前也都有试剂盒可用,如细胞外RNAs,研究人员可以离心细胞,分析或者冷冻上清液;如果是研究人类DNA,那么就可以采用细胞裂解,亲和绑定基因组DNA,洗脱其它成分。

一些稳定Buffers(Norgen,Qiagen等品牌都有)能用于中和降解DNA和RNA的酶,如果样品收集后无法麻烦放回冰箱,那么就可以利用这些试剂盒进行保存,如Qiagen 的RNAprotect Saliva Reagent,还有DNA Genotek的人类DNA,RNA收集试剂盒等。

而对细菌DNA和RNA感兴趣的研究人员来说,DNA Genotek的OMNIgene 试剂盒也是理想的长期保存方式,来自澳大利亚格里菲斯大学的David Speicher说。

蛋白是最不稳定的分析物,许多DNA和RNA的稳定试剂都不能保护蛋白,为了解决这个问题,Wong研究组在2012年的一篇文章中提出了一种稳定技术,就是预添加到RNAPro•SAL收集管中 (Method development for proteome stabilization in human saliva)。

冷冻保存时间?80℃冰箱可以长期保存唾液,但是这也是有期限的,Speicher研究组最近的研究提出了警告:无添加稳定溶液的唾液DNA,即使是保存在?80℃冰箱,14个月后就已经部分或完全降解了(Detecting DNA viruses in oral fluids: evaluation of collection and storage methods)。

因此一般来说最好样品分装,减少冷冻-解冻周期。

最后科学家们建议,如果你看了许多综述,深入了解了唾液的收集和处理之后依然不成功,那么可以打电话请教,“大多数科学家们都是乐于分享的,”Malamud说。

(转化医学网360zhyx.com)

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