诺奖热门：CRISPR基因编辑系统亮点研究小盘点

      今年的诺贝尔奖已经进入了目前的倒计时阶段，很多研究机构也陆续推出了自己的预测名单，其中不乏近几年红得发紫的技术：CRISPR基因编辑技术，那么CRISPR真的能上榜吗？

  首先按照诺贝尔奖评选方法惯例，一般来说获奖成果需要经过多年的效验验证，但也有人用事实反驳了这一观点——RNA干扰技术（RNAi）就是在其被出版公布后未到十年的时间里获奖的，还有细胞重编程技术（iPS）也在短短的几年时间内获得了诺贝尔奖评审委员会的青睐。
  其实说起来早在CRISPR作为基因编辑工具横空出世的数亿年前，细菌和古细菌就利用CRISPR系统非常精确的对几乎每个基因组中的任意序列进行精确修改了。
  时至今日，CRISPR/Cas9已经发展为生物学研究的有力工具；CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，其以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。CRISPR/Cas系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。
  目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白>以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。由于其对DNA干扰(DNAi)的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具，与锌指核酸酶(ZFN)及类转录活化因子核酸酶(TALEN)同样利用非同源性末端接合(NHEJ)的机制，于基因体中产生去氧核糖核酸的双股断裂以利剪辑。二型CRISPR/Cas并经由遗传工程的改造应用于哺乳类细胞及斑马鱼的基因体剪辑。其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点，未来将可应用在各种不同的模式生物当中。

本文盘点了CRISPR基因编辑技术的最新研究进展

  【1】Cell：新一代CRISPR基因组编辑系统
  在发表于Cell杂志上的一项研究中，哈佛-麻省理工Broad研究的张锋（Feng Zhang）及其同事们报告称发现了一种不同的CRISPR系统，其有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。他们描述了这一新系统一些出乎意外的生物学特征，证实可以操控它来编辑人类细胞基因组。
  人类基因组计划的主要领导者之一、Broad研究所所长Eric Lander说：“这一系统有着巨大的潜力推动遗传工程。这篇论文不仅揭示了从前未知的一种CRISPR系统的功能，还证实了可以利用Cpf1完成人类基因组编辑，其具有一些非凡和强大的特性。这一Cpf1系统代表了新一代的基因编辑技术。”
  在这篇新文章中，张锋和合作者们在不同类型的细菌中搜寻了成百上千种的CRISPR系统，寻找具有一些有用的特性，可改造用于人类细胞的酶。来自氨基酸球菌属（Acidaminococcus）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的Cpf1酶成为了两个有前景的候选物，张锋和同事们随后证实了其可以靶向人类细胞的基因组位点。
  【2】Cell：CRISPR破解细胞代谢难题
  在发表于7月30日《细胞》（Cell）杂志上的两篇研究论文中，来自麻省理工学院的研究人员揭示出了增殖细胞，包括肿瘤细胞需要线粒体呼吸作用的原因。尽管有许多其他的途经可以生成ATP，得不到呼吸作用提供的电子受体细胞无法进行增殖。
  在同期的Cell杂志上，麻省理工学院生物学教授、Whitehead研究所和Koch研究所成员David Sabatini报告称，他利用一种不同的方法确定了天冬氨酸和细胞呼吸作用之间的联系。Sabatini和同事们采用基因编辑工具CRISPR进行了遗传筛查，揭示出没有GOT1酶，在呼吸作用受到抑制时细胞将会死去。在正常情况下，GOT1消耗天冬氨酸来将电子传递至线粒体中。

  在进一步的研究中，研究人员发现当呼吸作用发生障碍时，GOT1将尝试通过催化逆反应，生成（而不是消耗）细胞质中的天冬氨酸来补偿线粒体天冬氨酸合成不足。研究人员证实，丙酮酸通过构建一个地方来放置电子，挽救细胞增殖，促进了这种天冬氨酸合成。

  【3】Cell：CRISPR/Cas9新发现
  来自上海交通大学、哥伦比亚大学医学中心的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9技术使得CTCF结合位点(CBSs)发生倒位，证实了CBSs的定向可以影响基因组的拓扑结构及增强子/启动子功能。这一重要的研究发现发布在8月13日的《细胞》（Cell）杂志上。
  上海交通大学特聘教授吴强（Qiang Wu）及哥伦比亚大学医学中心的Tom Maniatis教授是这篇论文的共同通讯作者。吴强教授长期从事神经系统、药物代谢系统和肿瘤基因家族的表达调控和在体功能研究，在Science、Cell、PNAS、Molecular Cell等期刊上发表了多项重要的研究成果。
  作为基因表达调控的中心环节，真核基因的转录调控至少可以分为三个层次：DNA水平、染色质水平和核水平。DNA水平调控主要是指DNA上的各种顺式作用元件，如启动子、增强子、沉默子、隔离子/边界元件等，通过和反式作用因子的相互作用而影响基因表达。
  【4】NEJM：CRISPR基因组编辑可以逆转肥胖

  近日，来自MIT和哈佛医学院的研究团队发现了一个控制人体代谢的重要通路，操纵这一通路可以改变脂肪细胞的功能。这项研究发表在顶级医学期刊《新英格兰医学》上，为人们提供了一条预防和治愈肥胖的新途径。“传统理论认为肥胖是食量与运动量失衡的结果，但这种观点忽视了遗传学因素对个体代谢的影响，”文章的通讯作者Manolis Kellis教授说。

  【5】Cell：CRISPR先驱张锋发表最新研究成果
  在发表于8月27日《细胞》(cell)杂志上的一篇新研究论文中，来自Broad研究所和东京大学的研究人员揭示出了金黄色葡萄球菌Cas9复合物(SaCas9)的晶体结构——这种高效的酶克服了在哺乳动物体内进行基因组编辑一个主要的挑战。
  今年4月，Broad研究所核心成员、麻省理工学院McGovern脑研究所研究员张锋（Feng Zhang）博士和同事们率先确定了SaCas9是一种有潜力的基因组编辑工具，其有望提高科学家们在体内编辑基因组的能力
  SaCas9比当前广泛使用的化脓链球菌的Cas9酶(SpCas9)小25%，从而解决了腺相关病毒（AAV）等载体负载能力有限，难以同时包装SpCas9酶和其他基因编辑必需的元件进入到单个病毒颗粒中这一问题。此外，他们还证实了SaCas9不仅与SpCas9 DNA切割效率相当，且具有相当的DNA靶向精确度。
  这项新结构研究将帮助研究人员改进及进一步操控这一有前景的工具加速基因组研究，使得运用这一技术来治疗人类遗传疾病离现实更近了一步。
  共同资深作者张锋说：“SaCas9是我们的Cas9工具箱中最新添加的工具，这一晶体向我们显示了它的蓝图。这项研究为优化这一技术实现全球健康利益指出了前进的道路。”
  【6】Angewandte Chemie：开发CRISPR-Cas9新型载体
  来自北卡罗来纳州立大学和北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员，第一次构建并利用一种由DNA组成的纳米载体，将CRISPR-Cas9基因编辑工具传送到了细胞培养物及动物模型的细胞中。
  存在于细菌和古细菌中的CRISPR-Cas系统，保护了它们抵御诸如病毒一类的入侵物。它是通过生成与入侵物特异DNA序列相匹配的，称作为CRISPR RNAs的小RNA片段来实现这一效应的。当这些CRISPR RNAs找到匹配序列时，它们会释放Cas9蛋白来切割DNA。近年来，因其作为一种基因编辑工具显示出的潜在应用——人们可以利用CRISPR RNA来识别相关DNA靶向区域，用Cas来切割它，CRISPR-Cas系统获得了研究团体极大的关注。

  而要让Cas9发挥作用，必须首先使之进入到细胞中。在这项研究工作，研究人员竭力证实了一种新载体在将完整的基因编辑工具——CRISPR-Cas9复合物导入到细胞中去的潜力。他们的研究论文发布在国际化学顶级期刊Angewandte Chemie上。

  【7】PLoS ONE：用CRISPR成功编辑蚊子基因
  最近，来自美国密苏里大学（MU）的研究人员，找到了一种有效的方法，来编辑蚊子的基因。MU兽医学院兽医病理学系的博士后研究人员Shengzhang Dong表示，这一新技术，为今后转基因蚊子的研究打开了新的途径，可使它们不能携带和传播对人体有害的病毒和寄生虫。相关研究结果发表在最近的《PLOS ONE》。延伸阅读：PNAS：用CRISPR技术编辑蚊子基因组。
  Dong是本文第一作者，他指出：“通过成功编辑埃及伊蚊（Aedes aegytpi，传播登革病毒的蚊种）的特定基因，我们已经构建了一种技术，可用于未来研究，靶定这种蚊子携带病毒的能力。”
  在他们的研究中，Dong和他的同事使用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在先前制备的一个转基因蚊子品系中，破坏蓝色荧光眼睛颜色基因。这个蚊子品系原本在其眼睛中表达蓝色和红色荧光的基因，因此，这些蚊子的后代不再显示蓝色，但在其眼睛中仍显示红色基因的表达。这一新性状在世代间是稳定遗传的。
  【8】Sci Rep：CRISPR提供新型乙肝治疗策略
  近日，来自德国Heinrich Pette研究所、University Medical Center Eppendorf和German Center for Infection Research (DZIF)等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中，在HBV基因组的S和X区中确定了交叉基因型保守的HBV序列，可被Cas9切口酶靶定进行特异性和有效的切割。这种方法不仅能破坏记者细胞系中的游离cccDNA和染色体整合HBV靶位点，而且也能破坏慢性感染和新感染肝癌细胞株中的HBV复制。这些数据表明，可以使用CRISPR/Cas9切口酶，作为HBV感染的新型治疗策略。

  在过去的几年中，至少已经开发出了三种革命性的基因组编辑技术，如ZFNs、TALENs和最近的CRISPR/Cas9 RNA引导的核酸酶系统。事实上，已有研究人员利用ZFNs、TALENs和最近的CRISPR/Cas9，在不同的检测系统中获得了对HBV的抗病毒作用。然而，除了核酸酶的最佳传递、循环HBV株中最佳靶位点的保守性之外，还存在潜在脱靶效应的高度相关问题。

  【9】Nat Commun：中国科学家发布CRISPR/Cas9基因编辑新成果
  来自中科院昆明动物研究所、华大基因研究院和芝加哥大学等机构的研究人员称，他们构建出了两种蝴蝶的高质量参考基因组，并利用CRISPR/Cas9技术对蝴蝶进行了基因编辑。相关研究成果发布在9月10日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。生物通
  中科院昆明动物研究所的王文（Wen Wang）研究员及芝加哥大学的Marcus R. Kronforst是这篇文章的共同通讯作者。王文研究员长期来一直致力于自然选择和人工选择下新遗传结构及其功能起源进化机制的研究。在Science、Nature Genetics、Nature Review Genetics、Nature Biotechnology、Nature等重要学术杂志上发表多篇论文。
  蝴蝶以翼模式异常多样化而著称，不仅在物种之间而且种群、性别、甚至季节间都存在差异。翼模式之所以非常多变，是因为它们具有多种功能，与从保护色到警戒色、拟态、温度调节和择偶等作用有关。除了翼模式，从行为、生物地理学到细胞生物学和生物化学，蝴蝶生物学几乎所有方面都很多样化。这些特点使得蝴蝶成为了一个探索遗传学、进化和形态多样化及物种形成的一个有前景的系统。
  【10】利用CRISPR-Cas9生成可遗传的基因修饰
  来自中国科学院上海植物逆境生物学研究中心、昆士兰大学的研究人员报告称，他们开发出了胚系特异性的CRISPR-Cas9系统改善在拟南芥中生成可遗传的基因修饰。这项研究工作发布在9月11日的《Plant Biotechnology Journal》杂志上。
  中国科学院上海植物逆境生物学研究中心主任朱健康是这篇论文的通讯作者。朱教授是植物抗逆生物学领域世界级领军人物之一，其及其领导的实验室在植物抗旱、抗盐与耐低温方面的研究硕果累累，在国内外享有声誉。是首批“千人计划”入选者，现为美国普渡大学生物化学系和园艺及园林系杰出教授，2010年当选为美国国家科学院院士。

  在过去的十年里，正向遗传学方法一直是基因功能研究的首选方法。利用化学药物或物理因素进行随机诱变被广泛用于生成大量的突变群体，随后从中筛选出感兴趣的表型。然而直到现在仍有大量的基因功能不明，并有许多基因的功能尚未得到实验验证。就这些基因来说，可以采取RNA干扰(RNAi)介导基因沉默一类的反向遗传学策略来进行功能缺失研究。但RNAi介导基因沉默的水平在品系间有差异，且无法保证数代内沉默的稳定性。

  【11】Nature：CRISPR–Cas的抑制系统
  来自多伦多大学、蒙大拿州立大学的研究人员，揭示出了anti-CRISPR蛋白抑制CRISPR–Cas的多种机制。新研究结果不仅为阐明CRISPR–Cas的功能机制指明了新途径，并有可能为更好地操控CRISPR–Cas系统提供大量有价值的工具。这一重要的研究发布在近日的Nature杂志上。
  细菌和感染它们的病毒（噬菌体）之间发生的生存之战，导致进化出了许多的细菌防御系统以及噬菌体编码的对抗系统。CRISPR和cas基因构成的适应性免疫系统是细菌保护自身对抗噬菌体最普遍的一种手段。CRISPR–Cas RNA引导的免疫系统广泛存在于原核生物中，对微生物的进化起重要作用。
  近年来，CRISPR–Cas系统的复杂功能机制，以及其能够轻松对任何有机体的遗传信息进行编辑，在基因工程领域和生物领域显示出的巨大应用潜力，吸引了研究人员对这些系统开展深入的研究（延伸阅读：张锋Nature发布CRISPR基因编辑新成果 ）。生物通 www.ebiotrade.com

  当细菌抵御外源DNA入侵时， CRISPR在前导区的调控下首先被转录为长的RNA前体（pre-crRNA），然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟CRISPR RNAs （crRNAs），crRNAs与Cas蛋白结合形成复合物最终识别并剪切与其互补的外源DNA序列。

（转化医学网360zhyx.com）

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