消化领域国际权威杂志发表思路迪联合中国学者关于肿瘤内异质性对药物治疗影响的最新进展

近日，国际著名期刊《Gastroenterology》(SCI影响因子 18.187)在线发布了思路迪精准医学研究中心联合复旦大学附属中山医院樊嘉教授关于肿瘤内异质性与药物反应的最新研究成果！这是至今为止关于肝癌肿瘤内异质性全球发表的影响因子最高的文章之一。

起因---------

肿瘤内异质性是困扰临床肿瘤治疗的一个长期问题，精准医疗的主要障碍之一也在于肿瘤内异质性。单细胞测序或者取自同一个患者不同部位的肿瘤测序发现，不同肿瘤细胞之间基因组突变存在着异质性，但是这种肿瘤内异质性对药物治疗直接的影响一直未被有效阐明。简单将肿瘤内异质性理解为分子靶向治疗的障碍，并不能解释临床一些患者虽然存在肿瘤内异质性，但仍然可以获益于单靶向治疗。究其原因，主要是因为没有合适的实验模型，使得这一重要的临床观察结果无法得以直接验证。

思路迪医药科技公司和樊嘉教授于2012年就此问题展开深入合作，基于思路迪领先的病人来源的肿瘤细胞（patient-derived cell, PDC）建系技术，在10个乙肝（HBV）阳性的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）病人肿瘤组织中取多个位点展开建系，最终成功建立了55株细胞系；由于病人肿瘤内异质性的差异，每位病人建成的细胞系分别有4-9株。这些细胞经过严格的细胞免疫化学、STR分析及传代稳定性（细胞增殖周期和细胞药物反应）测试，证明了建系的成功和原代细胞株的稳定性。

主要研究成果--------肿瘤内异质性细胞株的建立

为了分析肿瘤内异质性，思路迪和中山医院的研究人员针对这些成功建系的细胞展开了全外显子组测序（whole-genome sequencing,WES）和CytoScan HD基因拷贝数分析。这55株细胞中共发现有3670个非同义突变（non-silent mutation），平均每个病人的肿瘤组织含有93个突变，与已发表的三个大型肝癌单点WES测序结果（分别是67、85及58）相当。

而基于WES测序结果的分析表明，这55株细胞所对应病人（10个）的肿瘤内异质性分布在12.9%~68.5%期间，显示细胞株模型充分反映了肿瘤组织的肿瘤内异质性。这也表明已构建的这些细胞株可用来测试肿瘤内异质性与药物响应的关系。同时，WES结果表明这10个HCC病人携带有26个驱动基因变异，其中14个位于进化树的非树干部分（亚克隆），这提示肿瘤靶向治疗关键可能需要找到主干突变进行干预。除此之外，通过对这10个病人的进化树树干及非树干的核苷酸变异谱式聚类，提示树干的变异谱式和患者血清中的AFP（α-fetoprotein）水平显著相关（P=0.016），而AFP是肝癌病人重要的诊断和预后标志物。进一步的结论，思路迪新药研发临床前负责人林毅晖博士表示需要在更多样本上进行验证。

主要研究成果--------肿瘤内异质性对药物响应的评估

相比于前人一般基于肿瘤组织标本通过二代测序来研究肿瘤内异质性，这些保留肿瘤内异质性的细胞株还可以进一步测试异质性与药物响应的影响。针对这10个病人中呈现出驱动基因肿瘤内异质性变化（基因扩增或/和表达水平改变）的4个病人，药物敏感性测试结果表明，功能性的基因异质性变化（functional intratumor heterogeneity）是预测药物响应的重要决定性因素。如在case 307中，FGF19的扩增和高表达才是细胞株显示对FGFR4抑制剂敏感决定因素，尽管这些细胞株之间也存在其它基因变异的异质性，而仅是FGF19扩增的细胞株（FGF19低表达）则对FGFR4抑制剂不敏感。为了进一步验证这个观点，除了上文提及的这55株PDC，思路迪又启用了另外近百株来源于不同中国肝癌患者的PDC验证了该结论。这提示针对一些驱动基因，仅仅通过二代测序检测DNA水平上的基因变异，并不能精准的指导临床用药，需要综合考虑基因变异和对应的蛋白表达或者信号通路激活的状况。同时，该研究还解释了临床中一个长期困扰的问题，单细胞测序揭示同一个患者体内不同肿瘤细胞之间基因变异差异巨大，但临床治疗常常见到单靶向治疗获益的人群。这是因为如果关键驱动基因和其激活信号通路如果在不同细胞之间都保持一致性，那么其它非关键驱动基因的异质性差异并不带来药物响应的差异。
图2. Case 307药物响应及进化树整合图。ITH：肿瘤内异质性，Amp：扩增，exp.：表达，Sensitive：药物敏感性。（对应于原文Figure 3B）

主要研究成果--------基于肿瘤内异质性细胞株模型的联合治疗方案筛选

基于肿瘤内异质性PDC模型，研究人员还可以针对每个病人的不敏感细胞株利用高通量药物筛选方式，为每个病人的所有细胞株寻找到可能的个性化药物联合治疗方案。仍然以case 307患者来源的PDC为例，通过混合这些虽然来源于一个患者但驱动基因突变存在异质性的细胞株，研究人员测试了单药和联合用药的不同治疗效果。结果显示，联用的效果要明显优于单独用药。这些结果不仅第一次展示肿瘤内异质性如何影响药物的响应，同时也展示了PDC平台用来研究精准个性化用药的巨大价值。

图3. 单药及联合用药对Case 307的治疗效果评估。（对应于原文Figure 3E）

该项目的负责人之一，思路迪药物研发临床前负责人林毅晖博士表示，这种直接反应肿瘤内异质性的PDC模型，可以为肿瘤未来的联合治疗方案的开发提供极具价值的平台。思路迪公司也正基于这些平台，在肝癌的新药开发中，引入联合治疗的评价策略。 《Gastroenterology》系美国胃肠病学会（American Gastroenterological Association，AGA）的旗舰杂志，在胃肠病学领域排名第一，影响因子18.187。

文章链接：http://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(16)35033-8/fulltext
原文信息：Gastroenterology (2016), doi:10.1053/j.gastro.2016.09.008.

目前全球商业化可用的肝癌细胞系不超过40株，且其培养代数已无法跟踪。原代细胞株（PDC）因为相比商业化细胞株，其离体培养传代较短，更加贴近体内肿瘤真实情况。原代肿瘤细胞株PDC的广泛用途在该篇文章中得到部分展示，思路迪将在后续联合其他医院发表的论文中进一步展示不同肿瘤的PDC及PDX在肿瘤精准治疗以及生物标志物驱动的新药研发方面的应用。

经过近五年的努力，思路迪的科学家团队联合中国三甲医院，目前已建立了规模庞大的PDC平台。PDC模型即病人来源的肿瘤原代细胞株。运用临床肿瘤组织体外分离，获得肿瘤细胞，经培养后得到形态较为单一的上皮样细胞，通过STR验证、染色体数目异常，并在后续平行实验中被证明可以连续传代的细胞株即视为PDC。

思路迪公司创始人熊磊博士表示，精准医疗是一个系统工程，包括临床肿瘤患者的生物学特征描述（通过基因组测序、蛋白质组和代谢组学等技术）、精准候选化合物开发、临床前标志物研究、标志物驱动的临床试验等多个环节（见文章--------之前发表的国家财经周刊文章链接）。肿瘤贯穿组学研究，包括二代测序，揭示了大量新型基因变异，该平台可用于辅助候选化合物的遴选开发，并结合临床贯穿组学数据指导标志物研究，是精准治疗中不可或缺的一环。2016年美国国情咨文再次讨论精准医疗时，提到美国国立卫生研究院下一步计划重点包括肿瘤原代细胞株（PDC）和动物模型（PDX）的建设。（https://www.cancer.gov/research/key-initiatives/precision-medicine）思路迪早在4年前就投入数亿资金，启动中国病人来源的PDC建设，目前已经成为全球最大规模的肝胆系统肿瘤临床前研究平台。截止至2016年，思路迪联合医院共建立了肝胆系统肿瘤PDC 近2000株，这是迄今为止全球最大的肝胆系统原代肿瘤细胞系库。此外，PDC建系也拓展到其他中国高发性癌症，如食管癌、肺癌、结直肠癌、胆囊癌、头颈部肿瘤等，目前已成功建系数百株。PDC平台为新药研发和肿瘤标志物研究等肿瘤精准治疗中的一系列基础和临床问题提供了独特的研究平台，成为研究肿瘤精准医疗无与伦比的宝库。