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多发性骨髓瘤的CAR-T细胞治疗现状

首页 » 研究 » 免疫 2016-12-03 中华血液学杂志 赞(2)
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导读
多发性骨髓瘤(MM)是骨髓恶性浆细胞克隆增殖性疾病,导致骨髓造血受抑和溶骨性疾病。尽管应用传统化疗和造血干细胞移植以及靶向性药物治疗骨髓瘤,MM仍然不能完全治愈。多发性骨髓瘤(MM)是骨髓恶性浆细胞克隆增殖性疾病,导致骨髓造血受抑和溶骨性疾病。尽管应用传统化疗和造血干细胞移植以及靶向性药物治疗骨髓瘤,MM仍然不能完全治愈。


多发性骨髓瘤(MM)是骨髓恶性浆细胞克隆增殖性疾病,导致骨髓造血受抑和溶骨性疾病。尽管应用传统化疗和造血干细胞移植以及靶向性药物治疗骨髓瘤,MM仍然不能完全治愈。其中一个重要原因就是随着疾病进展而出现的免疫缺陷和免疫耐受。天然免疫系统中,MM患者NK细胞的细胞毒性和免疫调节功能都受到削弱,肿瘤相关性巨噬细胞被激活并分泌炎性因子如TNF-α、IL-6等促进MM细胞生长。MM患者中的抗原提呈细胞树突细胞吞噬细菌和抗原提呈能力下降,不能被肿瘤抗原有效刺激并上调T细胞活化的共刺激信号分子。获得性免疫系统中,MM患者的T细胞和B细胞的功能都被削弱,MM细胞和MM来源的骨髓基质细胞促使Treg/Th17平衡向Th17漂移,而Th17细胞具有免疫抑制功能并能促进肿瘤生长。T细胞治疗能有效杀伤肿瘤细胞,分泌大量促炎细胞因子从而改善MM患者的免疫功能。


基因工程技术处理的T细胞将肿瘤抗体特异性识别和共刺激信号结合,具有非MHC依赖性的肿瘤抗原特异性识别、增殖和杀伤能力。近年来,MM抗原特异性的嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor,CAR-T细胞)研究也陆续开展并获得初步成效。CAR-T细胞治疗成为有效治疗MM的新方案。

一、CAR-T细胞的结构和功能

嵌合抗原受体由胞外抗原结合区[由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成,中间由带韧性的绞链区连接形成单链抗体(scFv)]、跨膜区域和胞内信号转导区构成。CAR-T细胞的特殊结构决定了CAR-T细胞可以识别除了多肽段的广泛肿瘤抗原,包括神经节苷脂、有机糖类抗原等,并且识别肿瘤抗原的过程不受MHC分子的限制,胞内区域提供T细胞活化所需的共刺激分子,从而促进T细胞增殖,分泌促炎细胞因子,抗细胞凋亡等。

二、CAR-T细胞在MM治疗中的应用

1.CD19:

MM的异常浆细胞几乎不表达CD19,但是仍有一群低分化的CD19阳性细胞与耐药和疾病进展有关。基于这群与MM密切相关的CD19亚群,针对CD19的CART细胞(CTL019)治疗难治复发性MM已进入Ⅰ期临床试验(NCT02135406,美国宾夕法尼亚)。采用流式细胞术检测来源于复发MM患者的骨髓浆细胞,发现少量的CD19阳性细胞群,同时表达κ轻链和B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA),表现出恶性浆细胞的特性。患者在接受马法兰和自体造血干细胞移植(ASCT)后给予CTL019细胞治疗,体内单克隆免疫球蛋白(M蛋白)浓度和免疫球蛋白重链基因表达水平下降、IL-6下调伴随IFN-γ上调。10例接受临床试验的患者中有6例保持完全缓解,CTL019的不良反应主要为1级细胞因子释放综合征和ASCT引发的小肠结肠炎。由于患者接受了ASCT, CAR-T细胞治疗后的成效不排除ASCT的作用。

2.细胞膜表面糖蛋白(CS1):

CS1又被称作信号淋巴细胞激活分子(signaling lymphocytic activation molecule 7,SLAM7),MM细胞高表达CS1,而正常免疫细胞包括NK细胞、T细胞的某些亚群和正常B细胞都低表达CS1,骨髓细胞几乎不表达CS1。CS1诱导肿瘤生长相关通路,并且促进CD138+MM细胞与骨髓基质细胞的黏附,发挥促肿瘤作用。在对传统化疗敏感或者耐药的患者中,以CS1为靶点的单克隆抗体和DC疫苗能诱导强烈的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,并抑制MM细胞对骨髓基质细胞的黏附。在此基础上,以单克隆抗体为结构基础的CAR-T细胞治疗也具有可行性,且可避免单克隆抗体引起的免疫复合物沉积。有研究者将anti-CS1-scFv-CD28-CD3ζ片段插入逆转录病毒基因组,然后再转导进T细胞形成CS1-CAR-T细胞,发现这些CAR-T细胞对高表达CS1的MM细胞系有很强的杀伤作用,细胞活化标志CD69表达增高,脱颗粒作用增强,高表达IL-2和IFN-γ。同时将其应用于MM.1S免疫缺陷小鼠模型中,结果显示CS1-CAR-T细胞治疗后可发挥抗肿瘤作用,延长模型小鼠的生存期。

3.BCMA :

BCMA表达于MM细胞,而浆细胞和成熟B细胞低表达或者不表达BCMA。BCMA属于TNF受体超家族,结合B细胞活化因子(B-cell activating factor, BAFF)以及增殖诱导配体(proliferation-inducing ligand,APRIL),进而促进MM细胞生长和骨髓基质细胞的黏附,BCMA抗体对MM细胞系和原代MM细胞都具有杀伤作用。BCMA缺陷小鼠的B细胞数量正常,但B细胞功能受到抑制。上述研究结果提示BCMA适合作为MM治疗的靶点,并不会引起正常B细胞的功能受到明显影响。融合C12A3.2或者C11D5.3的BCMA-CAR-T细胞,分别以BCMA-1和BCMA-2为靶点,与BCMA阳性的MM细胞共培养后表现出明显的反应性增殖和杀伤活性,并且高表达IFN-γ。BCMACAR-T细胞能识别并杀伤MM患者来源的MM细胞,在MM模型小鼠体内通过穿孔素途径发挥抗肿瘤作用。

4.免疫球蛋白轻链:

B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)中,恶性细胞分泌κ链或者λ链,体内包含κ链或者λ链的抗体在功能上无明显差异,对κ链缺陷小鼠研究表明κ链缺陷并不导致对病原体体液免疫的明显下调和易感性的上调。在MM患者中,只表达κ轻链型者的MM细胞表面单克隆κ轻链抗原的阳性检出率为70%,λ游离轻链型者的MM细胞表面未检测到单克隆κ轻链抗原。Hutchinson等发现B细胞亚群中CD19+CD27++ CD38++细胞表达κ轻链抗原而其他B细胞亚群不表达该抗原。上述研究结果提示κ轻链抗原可以作为MM免疫治疗的靶点,并不会引起免疫功能紊乱。

κ轻链抗原的单克隆抗体MDX-1097通过ADCC作用杀伤MM细胞,来那度胺通过上调MM细胞表面κ轻链抗原的表达增强MDX-1097的作用。当可溶性κ轻链抗原达到较高浓度(>250 μg/ml)时,MDX-1097仍可选择性结合靶细胞,说明MDX-1097优先结合靶细胞。Ⅱ期临床试验中MDX-1097单药治疗可以诱导部分缓解,血清中κ轻链抗原和M蛋白的水平明显下降,10例MM患者6个月无疾病进展,部分3级不良反应包括心脏传导阻滞,肺炎等与MDX-1097无关。因此,以该单克隆抗体为基础的CAR-T细胞也会优先结合靶细胞,不受高浓度游离抗原的影响,与来那度胺协同有效杀伤MM细胞,诱导MM患者缓解。以恶性B细胞表面κ轻链抗原为靶点的46/28ζ+-CAR-T细胞在体外特异性杀伤κ+肿瘤细胞系,含有可溶性游离Igκ+的血浆不影响其杀伤效率。46/28ζ+-CAR-T细胞体外可以杀伤自体和同种异体B-CLL的恶性B细胞,并分泌大量IL-2, TNF-α和IFN-γ,在小鼠模型体内也有持续的46/28ζ+-CAR-T细胞增殖和抗肿瘤效应。对难治复发性NHL、CLL和MM的κ轻链CAR-T细胞治疗临床试验已在美国休斯顿开展(NCT00881920)。

5.Lewis Y:

Lewis Y抗原是结合于Ⅱ型血型寡糖链的四糖结构,与多种恶性肿瘤的发生和预后相关,包括肺癌、大肠癌等。临床研究证实以Lewis Y为靶点的单克隆抗体在上皮性肿瘤的治疗中安全、有效。Peinert等研究发现浆细胞恶变时会异常表达上皮性肿瘤抗原。随后,Peinert等发现急性髓系白血病(AML)细胞系KG-1a、K562细胞以及MM细胞系RPMI 8226-13细胞高表达Lewis Y,该研究中52%的MM患者和46%的AML患者表达Lewis Y,而CLL患者Lewis Y抗原表达阴性;以Lewis Y为靶点的Anti-LeY-scFv-CD28-ζ转导的T细胞(LeY-CAR-T细胞)对RPMI 8226-13细胞和原代MM细胞表现出特异性的增殖杀伤活性和反应性的IL-2和IFN-γ促分泌作用,且杀伤活性与LeY的表达水平成正相关。流式细胞术检测显示LeY-CAR-CD8+T细胞有中央记忆性T细胞和效应记忆性T细胞亚群的分化,LeY-CAR-CD8+T细胞能够在体内发挥长期的抗MM作用。在高表达Lewis Y的小鼠模型中,LeY-CAR-T细胞治疗组生存期较对照组明显延长。在临床前实验结果的基础上开展了LeY-CAR-T细胞对预后较差的MM和AML患者的Ⅰ期临床试验(NCT01716364,澳大利亚墨尔本)。

6.食管鳞状细胞癌抗原(New York esophageal-1, NY-ESO-1):

多种恶性肿瘤高表达NY-ESO-1,包括黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等,而正常组织不表达或者低表达NY-ESO-1。在60例MM患者中,35例(60%)患者在基因和蛋白水平检测出NY-ESO-1阳性表达,在细胞遗传学异常和复发的MM患者中NY-ESO-1的表达水平更高,提示NY-ESO-1与MM的疾病进展密切相关。NY-ESO-1是肿瘤/睾丸抗原(cancer/testis antigens)中最具免疫原性的抗原,能够在体内外诱导抗原抗体反应和特异性CTL。NY-ESO-1在多种肿瘤中表达升高的机制还有待研究,但是可以肯定的是NY-ESO-1高表达提示预后较差。所以,以NY-ESO-1为靶点的CAR-T细胞可以作为MM治疗的有力手段。识别NY-ESO-1157-165肽段和HLA-A*0201的CAR-T细胞(HLA-A* 0201/NY-ESO-1157-165 CAR-T细胞)中,40%的细胞为不表达CCR7的效应T细胞,5%为CCR阳性的记忆性T细胞,后者能在特异性抗原的刺激下重新分化为效应细胞,并分泌IL-2。临床前期实验证实了HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 CAR-T细胞的靶向治疗作用,并诱导免疫记忆,有望进行下一步的临床实验。对该CAR-T细胞的胞外抗体结合区(HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165)的抗独特型抗体Fab A4能够结合抗HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 CAR-T细胞,并以NY-ESO-1阳性细胞相似的方式活化T细胞,与NY-ESO-1157-165游离肽段相比,刺激CAR-T细胞增殖的能力更强。HLA-A* 0201/NY-ESO-1157-165 CAR-T细胞对高表达NY-ESO-1的肿瘤细胞具有特异性的杀伤作用,但是某些乳腺癌细胞和MM细胞低表达NY-ESO-1,限制了该CAR-T细胞的应用。NY-ESO-1的表达与启动子区域的去甲基化有关,而5-aza-2′-deoxycytidine(DAC)这种去甲基化的药物能够显著提高U266细胞中NY-ESO-1基因和蛋白水平的表达,并促进HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 CAR-T细胞分泌细胞因子和对肿瘤的杀伤作用。抗独特型抗体Fab A4和去甲基化药物DAC都能进一步提高HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165 CAR-T细胞的效率。

7.CD138、CD38和CD56:

CD138、CD38和CD56通常共同表达在MM细胞表面,在一项对306例MM患者的临床研究中,结果显示CD138、CD38和CD56的阳性检出率分别为100%、100%和78.7%,CD138作为MM的基本诊断指标,与肿瘤生长和MM疾病进展密切相关。CD138-CAR-T细胞联合泊马度胺体外杀伤RPMI8226和U266细胞,并诱导IFN-γ分泌。解放军总医院开展了CD138的CAR-T细胞靶向治疗的临床实验(NCT01886976),但目前尚无完整的数据。细胞表面的CD38活化后促进细胞底物的磷酸化激活NF-κB信号通路,而NF-κB信号通路与MM细胞的耐药密切相关。CD56是MM特异性的指标,随着疾病进展CD56的缺失提示MM的髓外浸润和浆细胞白血病。以CD38为靶点的CAR-T细胞(CD38-CAR-T细胞)在体外特异性杀伤MM细胞系细胞和原代MM细胞,CD56-CAR-T细胞(5× 106)可有效清除MM模型小鼠的肿瘤[33,34]。但是CD138、CD38和CD56也表达于某些正常细胞上,如CD138表达于支气管上皮细胞,CD38表达于造血干细胞、NK细胞、树突细胞等,CD56表达于中枢神经元和NK细胞。如何避免CD138、CD38和CD56的CAR-T细胞对正常组织细胞的不良反应是下一步研究的方向。

8.NK细胞活化受体NKG2D :

NKG2D受体是NK细胞和T细胞的活化受体,其配体为MICA、MICB、ULBP 1-3和Letal(ULBP4),表达于多种肿瘤细胞,包括淋巴瘤、白血病和MM。原代MM细胞和多种MM细胞系细胞均可表达NKG2D的配体,包括MICA和ULBPs。正常组织细胞不表达NKG2D的配体,当发生DNA损伤,感染或者恶变时才合成该配体。以患者和健康人的T细胞合成NKG2D-CART细胞,两者均以穿孔素的方式杀伤MM细胞,并且分泌IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和趋化因子CCL5, NKG2D-CAR-T细胞对MM患者的骨髓样本中少量的MM细胞都具有反应性IFN-γ分泌,采用流式细胞术检测NKG2D-CAR-T细胞,结果显示主要是表达CD27、CCR7、CD26L和高表达CD45RO的效应T细胞。游离的MICA分子通过下调NK细胞和T细胞NKG2D的表达抑制两种细胞对肿瘤的反应性,但该小组研究表明NKG2D-CAR-T细胞在较高的MICA浓度(>1.5×106pg/ml)时才会受到抑制。在小鼠5T33MM模型中,NKG2D-CAR-T细胞组生存期显著优于对照组,在注射NKG2D-CAR-T细胞1 d后,骨髓和脾脏中都检测到CAR-T细胞,并且小鼠血清中IFN-γ也随之升高。小鼠体内CD4+和CD8+T细胞细胞活化标志CD69表达上调,对再次注射5T33MM细胞表现出免疫反应,说明NKG2D-CAR-T细胞能在体内诱导免疫细胞的活化和免疫记忆T细胞。有研究表明NKG2D-CAR-T细胞可以下调体内Treg细胞数量,并且诱导骨髓细胞成为促进免疫的细胞亚型。蛋白酶体抑制剂硼替佐米、马法兰、多柔比星通过影响DNA损伤途径上调原代MM细胞NKG2D配体的表达,而沙利度胺和地塞米松没有这种效应,基于这个机制联用这些药物可能增强NKG2D-CAR-T细胞对MM细胞的识别从而提高杀伤效率。

9.CD44的异构体6(CD44v6):

CD44在造血系统肿瘤和上皮性肿瘤中选择性高表达,被认为是肿瘤干细胞的标记之一。转导了BCR-ABL基因的CD44-/-的造血干细胞不能诱导小鼠白血病的发生,CD44特异性单克隆抗体成功消除小鼠体内的AML干细胞,防止AML的发病。意义未明单克隆免疫球蛋白血症和MM患者来源的CD138+浆细胞均表达CD44v6,并且随着疾病进展表达阳性率也升高,CD44v6与13q14染色体缺失具有相关性,CD44v6在胰腺、乳腺、头颈部组织恶变中也起到关键作用。造血干细胞不表达CD44v6,在活化的T细胞、单核细胞、角质细胞也均呈低表达,使得CD44v6成为合适的CAR-T细胞靶点。CD44v6. CAR28z+T细胞体外杀伤表达CD44v6的MM细胞,流式细胞术检测结果显示CD44v6.CAR28z+T细胞中分化出表达IL-7Rα和CXCR4的记忆性T细胞亚群。来源于患者具有免疫负调节活性的骨髓间充质干细胞不影响CD44v6. CAR28z+T细胞的杀伤活性,体内外实验证明CD44v6. CAR28z+T细胞不会攻击正常角质细胞,不良反应仅限于可逆性的单核细胞减少。

(转化医学网360zhyx.com)

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