新一代测序：将如何改变法医基因组学？

自2009年成立以来，该研究所集中了一大批致力于完善遗传学方法的知名科学家，以增强几个研究领域，包括法医DNA。在UNTHSC的法医科学项目（全美只有14个）中登记的学生也参与了研究所的法医DNA项目，其中Budowle博士领导的研究小组不仅开展案例研究和人类身份检测，还参与了新技术的研究与开发，如新一代测序（NGS）。他们的目标是确定如何最佳地应用和优化NGS及其他方法，并开发操作步骤，以简化这些方法在法医学分析中的应用。

Budowle博士向我们谈论了他对NGS的想法以及NGS对法医基因组学的潜在影响。

Q：您在研究所中的团队开展了哪些法医DNA的研发工作？

Bruce Budowle（BB）：我们正在开发一些方法，以便更好地从可能影响我们分析的环境中回收DNA并去除抑制剂。我们也在研究新的遗传标记，让我们能够更深入地了解法医和人类遗传学问题，并鉴定可扩展我们能力的新技术。我们使用了多种新方法，从synchronous coefficient of drag alteration（SCODA）到挑战性法医样品中DNA的提取、纯化和浓缩，到NGS技术，它们可分析那些样品并帮助我们提取出最多的信息。

Q：您认为NGS在法医学中将是变革性的吗？

BB：我认为它将成为又一个变革工具，使法医学大大受益。这些年来我们已经有了很多工具，从限制性内切酶消化和Southern blotting到聚合酶链式反应（PCR），它们改善了分子生物学。如今，我们有了新的NGS工具，让我们能够更深入地看待事物，并以平行多重的方式分析更多的样品。NGS也让我们更够更灵活地解决我们面对的法医学挑战。

Q：NGS将要介入的现有法医学流程有哪些限制？

BB：法医学中最大的缺口是从我们能够获得的有限信息中得到优质的结果，这些信息来自少量、且质量较差的DNA样品。NGS让我们能够从极少量的DNA样品中获得更高质量的结果。

另一个限制是我们核心标记的限制。在很多情况下，更多的遗传标记将帮助我们回答法医学问题。例如，在地板上发现了一个血斑，我们将它与嫌疑人的样品（参考样品）进行比较时，我们直接比较遗传图谱。我们寻找与参考样品1:1对应的证据。在失踪人口案件中，我们开展亲缘关系分析，其中我们查看个体的部分遗传图谱，它可能与潜在或所谓亲属有相同部分。那意味着我们没有太多的信息来比较图谱。比较直系亲属可能要简单一些，如父母、子女、兄弟，或兄弟姐妹。鉴定同父异母的兄弟或堂兄弟，或将祖父母与孙子辈比较可能要复杂得多。有了利用NGS创建全部遗传标记的能力，我们将能够回答一些亲缘关系问题，而几年前这些问题的解决甚至是无法想象的。

Q：您如何看待使用NGS的法医学实验室？

BB：正如我之前说过的，NGS的一个真正好处是让我们能够分析更多的标记。我们能够将NGS应用在参考样品上，它将为我们分型法医样品带来更广阔的空间。因此我们将有一套扩展的标记，包括单核苷酸多态性（SNP），为我们带来了灵活性，朝着能最好地回答手中问题的方向推动分析，无论是亲缘关系分析、直接分析还是其他，而不是朝着现有的核心重复标记[标准串联重复（STR）]的方向推动我们的分析。

STR并没有错，但SNP在降解样品上比需要更大DNA片段的重复元件表现更好。如果我的实验室想要研究极具挑战性的样品，我会选择SNP。

此外，NGS将为我们带来更多标记，让我们能够覆盖整个法医学范围，并让不同国家的实验室能够更好地沟通。例如，如果一个实验室使用13个标记，而另一个实验室使用不同的20个标记，那么结果就无法轻松比较或用于鉴定嫌疑犯。如果我们能够同时对参考样品的一组标记分型，它包括每个国家选择的标记，那么我们就能够更高效地沟通。

Q：NGS与Sanger测序如何比较？
BB：当我们开展Sanger测序时，覆盖度通常是1x或2x。有了NGS，我们的覆盖度能达到1000x，并看到我们之前无法看到的差异。线粒体DNA（mtDNA）可能是个例子。由于线粒体基因组的复制保真性，我们的序列会有一些差异，导致个体的异质性或不止一个线粒体种类。通常用Sanger，我们只能看到一类或两类。我们能处理那种水平的变异，因为我们据此构建整个系统。而有了NGS，由于其覆盖深度，我们将看到10-100个mtDNA差异。新问题随之产生，我们必须将解释的线划在另一个地方，但这不是坏事。这只是NGS技术提供出色覆盖深度的事实。

Q：Illumina的系统能同时对大量位点测序，并一次测序多个样品。那种信息水平将带来什么？

BB：我们目前仍限于我们的分析，因为我们需要每个标记系统的试剂盒以及每个标记组的单独分析运行。NGS的好处在于所有标记都能以同一方式处理，使用相同试剂来获得结果。是的，你必须设计探针来鉴定你的位点，但技术都是相同的，因此我们可使用相似的试剂来解决所有感兴趣的标记，无论是STR、SNP、Y-STR，还是mtDNA。这对法医学将是一个真正的福利，因为它意味着一次分析运行能够提供一整套标记结果。

一次了解所有标记将使家族搜索等技术受益，当嫌疑人的DNA图谱不能直接匹配时，法医使用这种技术在已定罪的重犯数据库中搜索证据图谱。为了找到调查线索的潜在证据来源，我们接着查看是否有人与证据有着相近的图谱，那可能是证据真正来源的一位亲属。目前，那种类型的分析还有限制。还需要专门的试剂盒来查看Y染色体和X染色体标记。今后，我们希望有一种每个人都能依赖的技术，而所有标记都是基于那种技术。这就是NGS所具有的。

Q：您如何看待获得NGS结果对执法部门的价值？

BB：大部分犯罪实验室都为执法部门提供调查线索，以便反驳或确认一个人与物理证据的潜在关联。当你要排除某人时，这确实很重要。它帮助了那些错误关联的人，让案件能够向前发展。执法部门现在知道这个人不是生物学证据的来源，会调查可能参与其中的其他人。

NGS还将使失踪人口案件受益，鉴定人们，并帮助家庭寻找亲人。大部分示踪人口或无法鉴定的人类残骸案件并不仅仅是人们刚好走进树林，然后死了。绝大多数是被谋杀，发现和鉴定尸体是杀人案件调查的开始。因此NGS技术将以各种方式带来好处。它将帮助无辜的儿女，让执法部门能够鉴定出谁可能犯下罪行，并让失踪人口的家庭清楚到底发生了什么。它还能让警察将他们的资源集中在那些无法通过DNA来解决或给与指导的案件上。

Q：您如何看待NGS赋予法医基因组学以新的能力？

BB：NGS将会给许多领域带来好处 – 那些我们今天认为超出了法医学的领域。一个是我们目前正在做的，将药物基因组学与分子尸检相结合。我们知道，我们中的很多人都有着各种基因，有些是有益的，有些会带来问题，或在面临环境胁迫或压力时会带来风险。

有许多情况，可能对查看个体的遗传组成很重要，可协助确定死亡的原因或方式。例如，一个13天大的新生儿死于吗啡中毒。一般来说，这种情况发生时，警察会进行调查，因为这是一起不寻常的死亡。他们首先会调查父母，或有机会接近婴儿的其他人。他们也可能会调查医院是否疏忽。在这个特别的案例中，母亲在生产过程中会阴被侧切，之后被施予可待因。通过测序表明她是可待因的超级代谢型，有着两倍剂量的特定基因。由于可待因代谢成吗啡，而婴儿从母乳中获得吗啡。这个信息将调查带入一个完全不同的方向，因为我们强有力的证据表明死亡是意外，而非故意谋杀。有了NGS，我们能够一次对大量基因进行测序，并客观看待可能存在的所有变异，这为我们提供了信息，可能在富有挑战性的法医案件中协助我们确定死因。

Q：联合DNA检索系统（CODIS）包含美国联邦、各州及当地法医实验室提交的DNA图谱。您如何看待CODIS近期内的发展？
BB：CODIS需要开始准备其系统，以便更好地容纳NGS数据。CODIS目前集中在其核心内容，而除此之外的一切在其数据库中都无法很好地处理。有了NGS，我们认为不远的将来会添加30、40、50或200个标记，这将增加我们在参考数据中搜索部分标记的能力。大部分人被向CODIS上传东西的能力所驱动。因此，如果以后来自NGS系统的数据不能上传到CODIS，那么它将减慢数据库的发展。开始考虑如何容纳NGS可鉴定的标记，并将其纳入下一个版本中，这对CODIS来说势在必行。

Q：NGS如何用于生物血统？

BB：一个群体中有一些标记的频率比其他群体更高。如果你找到一个变异，那么你有可能推断出与个体的生物血统有关的东西。对于我们的失踪人口工作，找到更多的标记对我们来说价值巨大。目前，当执法部门找到人体残骸和头盖骨时，我们将它交给一位艺术家，他能修复头盖骨，为我们提供死者的素描。有时素描与真人非常相似，而有时又差挺远。

在表型领域，当我们视图画出那个人的样子时，我们需要做大量工作来确定颜色 – 头发颜色、眼睛颜色、皮肤颜色。现在我们想要聚焦在与更具体的特征相关的标记上，如鼻子、耳朵、嘴唇和软组织的性状，卷发还是直发。这些特征也许已足以勾起某人的回忆，帮助识别修复的个体，让我们能够迈入传统的DNA亲缘关系分析。我认为这才是NGS在生物血统标记发现上的真正价值。

其他可能有兴趣的领域是微生物法医学。我们的微生物法医学历史可追溯到炭疽信件袭击的那些日子，我们也继续参与生物安全的工作。我认为NGS可提供的巨大覆盖深度将有益于宏基因组研究，这些将在人类微生物组、挑战性的样品和潜在威胁上开展。它是这方面的理想技术。

Q：NGS还将提供哪些好处？

BB：NGS将让我们更多的分析自动化并通过软件来进行，而不是一个人查看数据、验证，第二个人又来查看和验证。我们将更多地依赖半专家软件系统的能力来解决那儿有哪些标记，且质量值及其他少量信息可让我们对结果更自信。这将由计算机在幕后完成，因此可改善我们的通量能力。

来源：生物通