EML4-ALK融合基因在肺癌中的诊治进展

<span>数十年以来对肺癌的诊治均是从组织学分类的角度着手。近年来随着分子医学的深入开展，对肺癌的认识已经从组织学水平向分子水平深入。在这个过程中，转化医学手段得到更多切实的应用，使得临床在肺癌的诊治方法上已经包括对表皮生长因子受体（</span>EGFR<span>）、</span>KRAS<span>等分子突变状态的检查和应用。在</span>2007<span>年又一个与肺腺癌相关的分子变异被发现，即</span>EMI4-ALK<span>融合基因。<!--more--></span>

<span><br/><strong>一、</strong><br/>
</span><br/><strong>EML4-ALK</strong><br/>
<span><br/><strong>融合基因的发现</strong><br/>
</span>

2007<span>年日本学者</span>Soda<span>等在</span>1<span>例吸烟的肺腺癌患者肿瘤组织中发现了</span>ALK<span>基因和</span>EML4<span>融合而成的具有致瘤性的变异基因。</span>EML4<span>和</span>ALK<span>两个基因分别位于人类</span>2<span>号染色体的</span>p21<span>和</span>p23<span>带，相隔约</span>10Mb<span>距离。这两个基因片段的倒位融合能够使得组织表达新的融合蛋白</span>EML4-ALK<span>。通过体外克隆性转化实验和体内基因重组基础上的肺部选择性表达实验证实：不同的</span>EML4-ALK<span>融合突变体均具有恶性转化和致瘤性能力。根据这些证据可以将融合基因定义为肺癌的一种新的癌基因。</span>

<span><br/><strong>二、非小细胞肺癌患者中</strong><br/>
</span><br/><strong>EML4-ALK</strong><br/>
<span><br/><strong>融合基因的发生率及其相关因素</strong><br/>
</span>

<span>京都大学的研究结果发现</span>111<span>例女性患者中</span>4<span>例有</span>EML4-ALK<span>融合基因，</span>202<span>例男性患者中仅有</span>1<span>例。另有研究发现，所有</span>EMLA-ALK<span>融合基因患者均为女性且少吸烟或不吸烟者。</span>

<span>美国麻省总医院研究结论认为，在经选择的患者中</span>13%<span>具有</span>EML4-ALK<span>融合基因，</span>22%<span>具有</span>EGFR<span>基因突变，</span>65%<span>两者均为野生型。与</span>EGFR<span>基因突变和两种基因均为野生型的患者相比，</span>EML4-ALK<span>融合基因在较年轻患者中和男性患者中更多。</span>EML4-ALK<span>融合基因患者与两种基因均为野生型患者相比，不吸烟或少吸烟者更少。</span>94.7%<span>的</span>EML4-ALK<span>融合基因存在于肺腺癌患者中，且此类融合基因患者接受</span>EGFR-TKI<span>治疗后效果不明显。</span>

<span>总的说来，</span>EML4-ALK<span>融合基因主要存在于不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者中，而且通常与</span>EGFR<span>基因不同时存在于同一患者。这些基因特征为进一步的</span>ALK<span>抑制剂的临床研究提供了有用信息。</span>

<span><br/><strong>三、</strong><br/>
</span><br/><strong>EML4-ALK</strong><br/>
<span><br/><strong>融合基因型肺癌的药物研发最新进展</strong><br/>
</span>

2010<span>年，</span>ASCO<span>大会上来自韩国的</span>Bang<span>等报道了辉瑞公司</span>PF02341066<span>（</span>crizotinib<span>）化合物Ⅰ期临床试验的结果：</span>82<span>例</span>EML4-ALK<span>融合基因阳性患者入组，其中</span>96%<span>（</span>79/82<span>）是肺腺癌。</span>50<span>例可评价疗效患者的客观有效率达</span>57%<span>，</span>8<span>周时疾病控制率</span>87%<span>，</span>6<span>个月时无进展生存率达到</span>72%<span>，主要不良反应是胃肠道反应，包括恶心、腹泻和呕吐，但均为轻微的不良反应，患者完全可耐受，</span>3<span>～</span>4<span>度不良反应仅见于实验室指标如丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的升高。由于有如此的有效率和安全性，美国</span>FDA<span>批准</span>crizotinib<span>直接进入Ⅲ期临床试验，目前基于</span>EML4-ALK<span>融合基因阳性的肺癌二线或三线的全球临床试验正在进行中，中国也参与其中。</span>

Crizotinib<span>被媒体称为“这是一个在合适的患者使用合适药物的典型代表”。然而，和已经应用于临床的激酶抑制剂（如伊马替尼和</span>EGFR<span>抑制剂）一样，</span>ALK<span>抑制剂</span>crizotinib<span>的应用也可引起靶激酶本身的继发耐药突变。</span>Choi<span>等报道了</span>1<span>例对初始</span>crizotinib<span>治疗高度应答而后复发的患者，其</span>EML4-ALK<span>激酶结构域内出现了两种继发突变（</span>C1156Y<span>和</span>L1196M<span>），这些新的突变导致了肿瘤细胞对多种</span>ALK<span>抑制剂</span>.<span>耐药。</span>Ariad Pharmaceuticals<span>公司正在开发另一种小分子化合物</span>AP26113<span>，这种药物有望成为</span>crizotinib<span>产生耐药性后的二线药物。现在还没有发布</span>ALK<span>的晶体结构，所以</span>Ariad Pharmaceuticals<span>公司应用了一种标准的同源建模方法来设计抑制剂。实验室和动物实验显示，</span>ALK<span>多个突变被确定授予抗</span>PF1066<span>，而对</span>AP26113<span>无抗药性。这些</span>ALK<span>的突变体进行了三个在小鼠肿瘤模型测试，在每种情况下，</span>AP26113<span>可有效阻止肿瘤的生长，而</span>PF1066<span>是无效的。此外，</span>AP26113<span>展现出对</span>ALK<span>阳性细胞大约为</span>PF106610<span>倍的选择性，并表现出优异的性能，包括每日</span>1<span>次口服给药的潜力。该公司计划在今年开始这个药物的Ⅰ期临床试验。</span>

<span>此外，“等最近对另一个强有力的和有选择性的</span>ALK<span>小分子抑制剂</span>TAE684<span>进行了研究。研究发现</span>TAE684<span>抑制</span>EML4-ALK<span>的活化及其包括</span>ERK<span>、</span>AKT<span>和</span>STAT3<span>在内的下游信号。他们用基因芯片分析开展</span>H2228<span>治疗非小细胞肺癌移植瘤模型后</span>TAE684<span>基因表达的变化有针对性的途径研究，并确定了</span>EML4-ALK<span>的抑制基因签名。该基因签名代表</span>1210<span>种已知的人类基因，这些基因代表的生物过程包括细胞周期、</span>DNA<span>合成、细胞增殖和细胞凋亡。他们还比较了</span>PF2341066<span>、</span>an-Met<span>和</span>TAE684<span>目前在临床中的试验效果，并证明</span>TAE684<span>是</span>EML4-ALK<span>的更强有力的抑制剂。</span>

<span><br/><strong>四、非小细胞肺癌中</strong><br/>
</span><br/><strong>EML4-ALK</strong><br/>
<span><br/><strong>融合基因的筛检</strong><br/>
</span>

<span>随着药物研发的顺利进展，一个重要的问题需要关注，即在临床患者中采用何种技术手段选择基因融合变异的患者呢？最早发展检测肺癌中</span>ALK<span>基因融合的技术是</span>DNA<span>水平的</span>FISH<span>及</span>mRNA<span>水平的</span>RT-PCR<span>。由于</span>ALK<span>基因在正常肺组织中表达水平极低，而一旦与</span>EML4<span>发生融合后则</span>ALK<span>蛋白表达水平显著上调，故</span>ALK<span>融合的肺癌组织也可以用免疫组织化学方法来检测</span>ALK<span>的表达水平而反映融合状态。</span>

<span>在非小细胞肺癌的病例中，多种</span>EMLA-ALK<span>融合基因的突变体己经被发现，多数是由于</span>EML4<span>基因的断裂点不同导致，因此精确诊断</span>EML4-ALK<span>阳性肿瘤需要检测</span>EML4<span>基因和</span>ALK<span>基因</span>cDNA<span>的所有融合方式，现已发现并确认至少</span>9<span>种</span>EML4-ALK<span>融合基因的突变体：</span>v1<span>、</span>v2<span>、</span>v3a<span>、</span>v3b<span>、</span>v4<span>、</span>v5a<span>、</span>v5b<span>、</span>v6<span>、</span>v7<span>。</span>Takeuchi<span>等在目前已知</span>EML4-ALK<span>融合转录突变体的基础上，采用三条引物组成的多重</span>RT-PCR<span>技术检测目前已知的多种突变体。且由于</span>EML4-ALK<span>为倒位融合，野生型组织细胞采用该</span>RT-PCR<span>不会产生扩增条带。该方法基于</span>PCR<span>技术，敏感且特异性好，粗略明确</span>EMLA-ALK<span>融合突变体。但也存在一些不足，对于潜在的非</span>EML4<span>基因与</span>EML4-ALK<span>融合则不能被检测到，而且对于潜在的</span>EML<span>的第</span>21<span>个外显子与</span>ALK<span>融合的转录突变体长度达</span>1284bp<span>，可能难于检测到。</span>

Mino-Kenudson<span>等采用</span>CST<span>（</span>Cell Signaling Technology<span>）公司的新型抗体来检测肺癌样本的</span>ALK<span>融合蛋白表达并用</span>FISH<span>技术来验证。结果提示</span>CST<span>公司的免单克隆抗人</span>CD246<span>抗体（</span>D5F3<span>或</span>D9E4<span>克隆，</span>Danvers<span>，</span>USA<span>）均能检测到</span>ALK<span>融合阳性的肺癌样本表达</span>EML4-ALK<span>融合蛋白，明显优于小鼠来源的单克隆抗体（</span>ALK1<span>克隆，</span>Dako USA<span>）。单克隆抗体结合免疫组织化学方法检测</span>ALK<span>的表达状态具有简便快速的优点，对于肺癌的组织细胞学等样本具有筛选价值，但也需要同时考虑到免疫组织化学方法总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判读需要进一步用</span>FISH<span>等技术来验证。</span>

<span>广东省肺癌研究所吴一龙教授课题组</span>Zhang<span>等采用</span>RACE-PCR<span>测序的新技术检测分析</span>ALK<span>的融合变异。该方法的独到之处在于采用含有反转录的</span>RACE<span>结合两轮</span>PCR<span>技术来富集扩增</span>ALK<span>的融合变体，敏感度高。该方法不仅检测</span>EML4<span>与</span>ALK<span>的融合</span>.<span>同样可以检测到其他任何基因与</span>ALK<span>的融合，且进一步通过测序的手段能够明确融合是来自</span>EMLA-ALK<span>多种突变体中的具体哪一种。这对临床的指导意义可能更大。已知不同</span>EMIA-ALK<span>融合突变体的酪氨酸激酶活性程度有明显差异，因而可能对临床用药剂量具有一定的指导价值。这个问题有待于在临床试验中进一步分析验证。</span>

<span><br/><strong>五、小结</strong><br/>
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EML4-ALK<span>融合基因作为具有独特临床特征的肺癌的又一分子标志物，昭示着针对</span>ALK<span>的靶向治疗将促使肺癌个体化治疗更加精准有效和逐步走向成熟完善。然而，对</span>EMI4-ALK<span>融合基因的检测方法还有待于改善，以提高其检出的特异性和敏感性。假以时日，对于</span>EML4-ALK<span>融合基因抑制药物的研发与改进，定将取得突破性进展。</span>

<br/>来源：中国医师进修杂志