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腾讯登录详解2014诺贝尔化学奖：超越光学显微成像极限
| 导读 | 2014年度诺贝尔化学奖授予两名美国科学家以及一名德国科学家，以表彰他们在“超高分辨率荧光显微技术方面的贡献”。来自美国 霍华德·休斯医学研究所的埃里克·本茨格(Eric Betzig)，德国马克斯普朗克 生物物理化学研究所的史蒂芬·赫尔(Stefan W. Hell)以及美国斯坦福大学的威廉·默尔纳(William E. Moerner)共同分享了今年的化学奖。 |
北京时间10月8日消息，2014年度诺贝尔化学奖授予两名美国科学家以及一名德国科学家，以表彰他们在“超高分辨率荧光显微技术方面的贡献”。来自美国 霍华德·休斯医学研究所的埃里克·本茨格(Eric Betzig)，德国马克斯普朗克 生物物理化学研究所的史蒂芬·赫尔(Stefan W. Hell)以及美国斯坦福大学的威廉·默尔纳(William E. Moerner)共同分享了今年的化学奖。
光学显微成像技术向纳米尺度的迈进
血红细胞，细菌，酵母菌以及游动的精子。当17世纪的科学家们第一次在光学显微镜下看到这些活生生的生物现象时，一个崭新的世界在他们的眼前打开了。这就是光学显微成像技术的诞生。自那以后，光学显微镜已经成为生物学研究领域最重要的工具之一。其他显微成像技术，如电子显微镜，都需要进行样品的制备，而这样的制备过程会杀死细胞。
借助分子发光技术超越物理极限
然而，长期以来，光学显微成像技术的发展却一直受制于一个物理极限值的约束。1873年，显微技术专家Ernst Abbe提出了传统显微成像技术的物理极限值：这种技术的分辨率将永远不能超过0.2微米。这一预言导致在20世纪的绝大多数时间里，科学家们都相信光学显微成像技术将永远无法让他们突破到更细微的尺度上(Fig 1)。一些细胞内部的细胞器，如为细胞活动提供能量的线粒体，它们的轮廓是可以看到的。但要想进一步观察更小的对象，如细胞内部单个分子之间的相互作用则是根本不可能做到的。这就有点像是观察一座城市，你可以看到城市里林立的高楼，但却无法看清其中生活的居民们进进出出的日常生活。为了了解细胞的日常运作，科学家们需要对单个分子的活动进行追踪。
图一： 在19世纪末，恩斯特•阿贝（Ernst Abbe）对光学显微镜的分辨率限制做出了界定，认为大约是光波长的一半，即约为0.2微米。这意味着科学家们可以辨别完整细胞，以及其中一些被称为细胞器的组成部分。然而，他们却无法分辨一个正常大小的病毒或者单个蛋白质。
然而Abbe提出的这一物理极限由于今年的诺贝尔化学奖获奖人的工作被突破了。从理论上说，现在再也没有任何障碍，阻止科学家们对更小尺度上的物体进行观察了。于是，显微成像变成了纳米显微成像。在突破Abbe极限的方案中，有两种各自独立发展出来的技术方法。而整个故事还得从1993年位于芬兰西南部的一间学生宿舍里讲起。有一天，当史蒂芬·赫尔在翻阅一本量子光学书时，他想到了一个绝妙的主意。
直面Abbe极限的年轻挑战者
1990年在海德堡大学获得博士学位之后，史蒂芬·赫尔一直在设想超越一个多世纪前提出的Abbe极限的方法。想要挑战一种现存的主流观点是令人兴奋的。但当时德国的几乎所有顶尖科学家都对他的想法持怀疑态度，于是赫尔转而向遥远的北方寻求支持。芬兰图尔库大学一名主攻荧光显微成像技术的教授给了他在自己研究组里的一个职位。赫尔坚信一定有着可以突破Abbe极限的方法。而当他在一本量子光学书中读到有关受激发射的内容时，一种全新的想法在他的脑海中逐渐成型。2009年时他曾经这样评价当时自己的感受：“当时，那个想法吸引了我。我终于有了明确的想要去追求的方向。”
解决方案：纳米尺度的闪光样品扫描
在芬兰图尔库大学，赫尔专攻所谓荧光显微成像学，这是一种技术方法，科学家们借助荧光分子对细胞的局部进行成像。比如说他们可以利用荧光抗体结合的方法来观察分子DNA。他们利用短暂的闪光激发该抗体，让它们在短时间内发光。如果抗体与DNA结合了，那么它就会从细胞的核心部位发光，因为那里正是细胞核内存储DNA的位置。通过这种方法，科学家们可以判断某一特定分子的所在位置。但这样也仅仅是能让科学家们确定大团分子，如缠绕纠缠的DNA分子的所在位置。这样做的分辨率太低，难以区分出特定的DNA链。你可以想象一下看到缠绕的纱线，而看不清单根纱线的场景。
而当史蒂芬·赫尔读到有关受激发射的内容时，他意识到应当有可能制成一种装置，其使用纳米闪光灯扫过样品，每次一纳米。利用受激发射原理，科学家们可以冷却荧光分子。它们将一束激光束对准一个分子，后者立即失去能量并变得暗淡。在1994年，史蒂芬·赫尔发表了一篇文章陈述了自己的这一想法。在这一他设想中的技术方案，也就是所谓“受激发射减损技术”(STED)中计划采用闪光来激发所有的荧光分子，随后利用另外一次闪光让所有分子荧光熄灭——那些位于中部位置上纳米尺度空间内的除外(图 2)。当进行记录时则只记录下这一部分。让这一光束扫过整个样品表面，并连续记录光强信息，就有可能得到一张整体图像。每次允许发出荧光的空间区域越小，最后得到的图像分辨率便越高。于是，从原理上说，对于光学显微成像的极限再也不复存在了。
图2：在常规光学显微镜中，可以区分线粒体的轮廓，但其分辨率却无法超越0.2微米。
在德国研制首台纳米闪光装置然而史蒂芬·赫尔的理论文章并没有立即在学术界引起关注，但却足以让史蒂芬·赫尔在德国马克斯普朗克生物物理化学研究所获得一个职位，在接下来的数年里，他将自己的设想逐渐变成现实：他开发出了STED显微镜。2000年，他证明了自己的技术方法在实际工作中是可行的。当时他对大肠杆菌进行了摄像，其分辨率是此前任何光学显微镜都从来未能达到过的(图 3)。
STED显微镜通过多次小区域上采集光线并最终形成整体成像图。与之相反，此次获奖的第二种技术方案，即所谓“单分子显微成像技术”，则涉及多幅整体图像的叠加。埃里克·本茨格和威廉·默尔纳各自独立的奠定了这项技术的基础。这一技术的最初故事是从默尔纳首次成功探测到单个微小的荧光分子开始的。
图3：第一张由斯特凡•W•黑尔（Stefan W. Hell）使用STED显微镜拍摄而成的图像。左边为使用传统显微镜拍摄的大肠杆菌，右边是使用STED显微镜拍摄的同样的大肠杆菌。STED图像的分辨率是前者的3倍
在大多数化学方法中，比如测量荧光的吸收，科学家们一般都是同时对数以百万计的分子同时进行观察。这类实验得到的结果一般代表的是典型或平均分子的情况。科学家们只能接受这样的结果，因为这是无法改变的。但长期以来他们都一直梦想着有朝一日能够对单一分子进行直接的测量，因为更加详尽和丰富的认识或许能够带来对一些现象，比如疾病发展过程更深刻的理解。
于是，在1989年，当默尔纳成为世界上首位成功测量单个荧光分子光吸收的科学家时，那是一项伟大的成就。当时他在IBM位于加州的研发中心工作。这项实验开启了通往新的未来的大门，并启发大量化学家将他们的注意力转向单分子研究，其中一位便是埃里克·本茨格。
8年之后，默尔纳朝着单分子显微成像技术又向前迈进了一步，他在此前曾经被授予诺贝尔奖的绿色荧光蛋白技术(GFP)的基础上进行了发展。
带着开关的小灯泡
1997年，默尔纳来到加州大学圣迭戈分校，后来被授予诺贝尔奖获，GFP技术的发明人钱永佑教授也在这里任职。钱教授从水母体内分离出发绿色荧光的蛋白，其重要意义在于它能够让活体生物体内细胞的其他蛋白质同样变得可见。运用基因技术，科学家们将这些绿色荧光蛋白与其他类型的蛋白进行耦合。这样，利用绿色荧光作为标记，科学家们便能知道那些被标记的蛋白质在生物体内所处的位置。
默尔纳注意到GFP荧光分子的一种，其荧光可以被随意的开启或关闭。当他用波长488纳米的光线激发这一蛋白质时，它开始发出荧光，但一会之后它就熄灭了。此后不管他再使用多少光线去照射它，这个蛋白质的荧光都已经死了。然而，此后他发现，如果使用波长为405纳米的光线去照射它，那么这个蛋白质又能再次复活并发出荧光。当该蛋白质被再次激活，它会再次发出波长为488纳米的荧光。
默尔纳将这些可以被激发的蛋白质融入一种溶胶，使其均匀散布其中，这样其单个分子之间的距离就能大于当年Abbe衍射极限所限定的0.2微米的长度。由于这些分子被分散了开来，一台常规的光学显微镜便可以区分来自单个分子发出的荧光——它们就像是带着开关的微小灯泡。有关这一实验的结果被发表在1997年的一期《自然》杂志上。
通过这一发现，默尔纳显示了通过光学手段操控单个分子荧光的可能性。这一结果解决了埃里克·本茨格两年来一直困扰着他的问题。
厌倦了学术界，但仍对Abbe衍射极限感到着迷
与史蒂芬·赫尔一样，埃里克·本茨格对于突破Abbe设下的衍射极限非常着迷。1990年代初，本茨格正在美国新泽西州贝尔实验室开展一种名叫“近场光学显微镜”的研究工作。在近场光学显微镜中，光线是从极为贴近样品表面，距离仅有几个纳米的薄片上发出的。这种显微镜可以突破Abbe的衍射极限，但这一方法也有着难以克服的缺陷。比如说，其产生的光线作用距离极短，因此难以呈现细胞表面以下的深处结构。
1995年，埃里克·本茨格得出结论，他认为近场光学显微镜已经没有多少进行进一步改进的空间。除此之外，他也感到自己并不适合学术界，因此决定结束自己的学术生涯。但他对自己接下来要去哪里感到迷茫。他从贝尔实验室离职了，但有关Abbe衍射极限的问题仍然萦绕在他的脑海之中。在一个冬日的散步期间，他突然产生了一个新的念头：是否有可能利用不同分子的不同特性来避开Abbe衍射极限的问题，比如利用那些能够产生不同颜色荧光的分子？
受到默尔纳和其他科学家研究的启发，埃里克·本茨格此前已经利用近场光学显微镜观察到了单分子的荧光现象。现在他开始思考这样一个问题：如果不同的分子发出不同颜色的荧光，比如红色，黄色和绿色，那么利用常规显微镜是否也有可能达成这样高的分辨率？他的具体想法是让显微镜每次只记录一种颜色。如果所有发出同一种颜色的分子都散布开来，它们之间的间距都超过Abbe衍射极限所限定的0.2微米，那么这些单个分子的所谓位置便能够被非常精确的确定下来。下一步，当不同颜色下记录的图像被叠加在一起，那么此时得到的图像分辨率将会大大超越Abbe衍射极限所限定的水平，而红色，黄色和绿色的分子即便它们各自之间的距离仅有几个纳米，此时将仍然可以被分辨出来。通过这种方法，Abbe的衍射极限问题就可以被绕开了。然而还存在一些实际问题，比如他找不到具有足够可区分光学特性的分子。
1995年，埃里克·本茨格在《光学通报》杂志上报告了自己的理论设想，并在随后离开了学术界并到他父亲的公司工作去了。
重返学术界
有很多年时间，埃里克·本茨格与学术界完全脱离了。但有一天，渴望科学的种子再次在他身体里萌发了，于是他的目光再次回到了科学领域，这一次他注意到了关于绿色荧光分子的消息。他很快意识到这种可以让活体细胞内其他蛋白质发光的荧光蛋白质或许可以被用来绕开Abbe衍射极限。
真正的突破出现在2005年，这一年他无意间发现了一种可以随意开启或关闭其荧光的蛋白质，跟默尔纳在1997年在但分子层面上所观察到的情况很像。本茨格意识到这正是实施10多年前他头脑中那个想法所缺少的工具。荧光分子并不一定需要具有不同的颜色，它们只要能在不同的时间发出荧光就可以了。
通过图像叠加方法突破Abbe衍射极限
短短一年之后，埃里克·本茨格与其他研究激发荧光蛋白的科学家们一起，证明了他的技术方案在实践中是可行的。在许多不同的实验中，有一项实验是将该蛋白质与溶酶体外膜结合，这里是细胞的回收站。在光信号刺激下，蛋白质发出荧光，但由于光线非常弱，只有一部分的蛋白质发光。由于数量少，几乎每个分子之间的距离都要超过Abbe衍射极限所限定的0.2微米长度。于是，在显微镜下，每一个发光分子的位置都可以被非常精确的记录下来。过了一会，等到这些分子的荧光逐渐熄灭之后，研究组再激活另外一组蛋白质分子，让它们发出荧光。同样的，只有一部分分子会发光，同样的，记录下每一次发光分子的图像。这一过程被一再重复。
当本茨格最终将所有这些图像叠加在一起时，他得到了溶酶体外膜结构的超高分辨率图像。这张图像的分辨率远远超出了Abbe衍射极限所限定的值。2006年，他们在《科学》杂志上发表了有关研究结果的论文，这是一项突破性的成就。
图4：单分子显微镜原理
图5：中间图像为溶酶体膜（lysosome membranes），是埃里克•白兹格（Eric Betzig）首次使用单分子显微镜拍摄的图片之一。从中选取0.2微米的阿贝衍射极限大小显示在右边。左边为用传统显微镜拍摄的图片，可以看出图片分辨率提高了很多倍。
探索仍在继续这两种分别由埃里克·本茨格，史蒂芬·赫尔以及威廉·默尔纳发展出来的技术方法自那以后已经导致多项纳米尺度成像科技的诞生，目前已经在世界各地得到广泛应用。目前这三位获奖人仍然活跃在这里研究领域的第一线，与越来越多投身这一研究领域的科学家们一道继续开展工作。当他们将强大的纳米成像设备对准组成生命的最微小组件，他们帮助人们获得了大量最新的知识。史蒂芬·赫尔目前正致力于对神经细胞的精密探查，以便更好加深对大脑突触的理解；威廉·默尔纳正在开展与亨廷顿综合征有关蛋白质的研究，而埃里克·本茨格正在努力追踪胚胎内部细胞分裂的过程。这些都还只是他们正在从事的大量工作中的几个案例。
但有一件事是可以肯定的，那就是2014年度的诺贝尔化学奖获得者们已经为我们奠定了坚实的基础，去追寻人类最为重要的知识。（转化医学网360zhyx.com）
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