乙型肝炎病毒 DNA 定量检测临床应用的若干问题与思考

  HBV DNA 检测技术目前已经在临床中普遍应用。但在实际工作中，不少临床医师对如何认识、评价和使用 HBV DNA 检测结果仍存在着一些困惑，甚至可能因认识不足、应用不当导致了错误的诊断和治疗。现就 HBV DNA 定量检测临床应用的基因诊断和临床治疗研究阐述如下。

  一、如何正确认识和评价 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度

  任何一种基因检测技术都有一定的灵敏度，即该方法的最低检测限。目前公认的 HBV DNA 定量检测国际“金标准”是罗氏公司生产的 COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM) 实时荧光 PCR HBV DNA 定量检测试剂盒，其血清 HBVDNA 检测灵敏度为 170 拷贝／mL (30 IU/mL)。有学者将雅培公司生产的 HBV DNA 定量检测试剂盒与 CAP-CTM 进行了比较，发现两者灵敏度相似。
  目前，国产的 HBV DNA 实时荧光 PCR 定量检测试剂盒灵敏度为 1×10^3 拷贝／mL，与国外产品尚有一定差距。虽然某些国产试剂盒声称检测灵敏度可达 250 或 300 拷贝／mL，但无充分实验室或临床证据。
  有研究显示，将 24 份罗氏公司第一代产品 COBAS Amplicor 试剂盒 HBV DNA 定量在 300-1 000 拷贝／mL 的患者血清，分别采用 2 个国产 HBV DNA 试剂盒进行检测，发现后者的漏检例数分别达 11 例 (45.83%) 和 22 例(91.67%)。
  与国产试剂盒相比，罗氏公司的 CAP-CTM 检测系统之所以具有较高的灵敏度，除试剂本身的质量及配套的仪器性能等因素外，从技术层面看，尚有其他重要原因：
  ①该检测系统在从血清中分离、提取 HBV DNA 时，采用的是全自动的 HBV DNA 提取系统 COBAS AmpliPrep，且采用的是磁珠吸附柱纯化，尽可能地避免了提取过程中 HBV DNA 的丢失，而国产试剂盒均采用手工提取，且多为煮沸法、Chelex 树脂法等，提取过程中 HBV DNA 丢失较多。
  有学者研究发现，即使采用同一检测试剂，血清标本的处理方法对 HBV DNA 检测结果也有着直接的影响，煮沸法和 Chelex 树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的 52. 78% 和 55. 56%。在阳性标本中，同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低 1-2 lg 拷贝 /mL。
  ②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM 试剂盒用于检测的每份血清量达 650 uL，而国产 HBV DNA 检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为 50-100 uL，但两者提取到的待测 HBV DNA 产物容积一般均为 50 uL。而且，由于反应管体积的限制，进行 PCR 检测时只能再取其中的 2-5 uL 的 HBV DNA 提取产物作为 PCR 检测的模板。
  在血清 HBV DNA 含量较低时（1×10^3 拷贝 /mL 以下），在有限的 2-5 uL HBV DNA 提取产物中，能“抓到”多少 HBV DNA 分子进入到 PCR 检测反应管，并被仪器“捕捉”到荧光信号，就存在着一个概率问题：进入检测体系的血清标本量越多，“抓到”足够多的 HBVDNA 分子的概率就越大，荧光仪捕捉到荧光信号的概率也就越高；反之，血清标本量越少，检出概率越低，漏检率也就越高。显而易见，罗氏试剂盒由于增加了进入检测体系的样品容积，其敏感度理论上就比国产试剂盒提高 6-13 倍。
  国产 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度偏低可以解释某些临床现象：
  ①CHB 或乙型肝炎肝硬化患者多次检测血清 HBV DNA<1×10^3 拷贝 /mL，在除外合并脂肪肝、药物性肝损害等其他病因后，仍反复出现血清 ALT、AST 升高；
  ②或在接受抗病毒治疗后，监测血清 HBV DNA 已长时间处于不可测水平以下，但血清 ALT 和 AST 即使加用“降酶药”后仍持续异常。其中的原因可能就是患者体内存在低水平的 HBV 复制，但国产试剂盒却未能检测出。
  鉴于我国大多数乙型肝炎患者的经济承受能力有限，没有必要普遍推广使用高灵敏度、高成本的进口试剂盒，因为目前尚无彻底清除 HBV DNA 的药物，即使患者血清 HBV DNA 降到更低的不可测水平，甚至发生血清 HBsAg 转换，但肝脏中仍然会有 HBV DNA 或 HBV cccDNA 存在。
  在抗病毒治疗的动态监测过程中，只要患者血清 HBV DNA 持续 <1×10^3 拷贝／mL，结合生物化学、影像学和（或）组织学等指标，就足以对疗效进行恰当的评价。只有在 HBV DNA 水平用国产试剂盒检测 <1×10^3 拷贝／mL，但①患者未经治疗，ALT 持续异常；
  ②或在抗病毒治疗过程中，出现 ALT 持续不能复常，或复常后又反弹；③或肝脏影像学、组织学有进展；④或有肝硬化、肝细胞癌家族史等高危因素；⑤或 HBV 血清学标志物阴性、但疑有隐匿性乙型肝炎等少数情况下，可以考虑使用高灵敏度的 HBV DNA 检测试剂盒。

  二、如何看待 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围

  任何检测方法，只有在一定的范围内才有效，即该方法检测的线性范围。检测线性范围包括检测的上限和下限，下限即为检测灵敏度，上限即为其最高检测浓度，待测标本中，如目标分子的浓度低于检测下限可能导致漏检；如高于检测上限，由于高浓度底物的抑制效应，亦有可能导致误检甚至漏检。
  影响 HBV DNA 定量检测试剂盒线性范围的因素有：①定量标准品设置的范围。荧光定量 PCR 检测时，一般均采用标准曲线法，只有检测数值位于标准品的定量范围内，结果才是有效的、准确的，不能通过统计公式任意加以外推。部分国产 HBV DNA 定量检测试剂盒说明书上标明检测线性范围为 500-1×10^8 拷贝／mL，但实际可能只有 1×10^4、1×10^5、1×10^6 和 1×10^7 拷贝／mL 4 个数量级的标准品，显然是不严谨的。
  如待测标本的检测结果低于 1×10^4 拷贝／mL 或高于 1×10^7 拷贝／mL，均是不可靠的。②检测试剂的质量，如 PCR 引物和荧光探针的保守性、通用性，试剂盒所采用的 Taq 酶的扩增能力、热稳定性，以及反应体系抗干扰系统的设置等，均会直接影响 PCR 的扩增效率和检测线性范围。
  HBV DNA 检测试剂盒的线性范围越大，表明其检测效能越高。罗氏、雅培和 Qiagen 公司的 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围分别为 30-1×10^8 IU/mL、10-1×10^9 IU/mL 和 20-1×10^8 IU/mL。根据作者多年的基因实验室和临床工作经验，多数国产试剂盒的线性范围在 1×10^3-1×10^8 拷贝／mL，虽检测效能较国外试剂盒小 2 个数量级，但基本能满足临床需要。
  建议对于使用国产试剂盒检测结果为 1×10^8 拷贝／mL 或以上的血清标本，实验室技术人员可常规对标本进行 1:100-1:1 000 的稀释，然后再次进行检测。这样能确保血清高载量 HBV DNA 的样品检测结果更准确，在抗病毒疗效监测中也能更有效地反映患者实际 HBV DNA 的下降程度。

  三、如何看待不同实验室之间 HBV DNA 载量检测结果和单位的差异

  常会看到同一患者提供的在同一家医院相近时间段（未经抗病毒治疗），或同期在不同医院（实验室），所测得的 HBV DNA 载量有差异，甚至有很大差异。究其原因，应该包括两个方面：一是检验技术本身固有的“缺陷”，或必然存在的误差；二是试剂、设备和人员技能的差异。
  由于 HBV DNA 检测结果是指数形式，且 HBV DNA 本身易发生突变而影响引物和探针的结合，因此不同厂家的 HBV DNA 检测试剂盒之间的检测结果不具有可比性。
  在一项研究中，来自美国 9 个独立实验室的学者，对 67 份血清标本分别采用雅培公司的 HBV IUO、罗氏公司的 CAP-CTM 和 HighPure-CTM、Qiagen 公司的 artus HBV TMASR 等 HBV DNA 检测试剂盒进行检测，发现尽管上述试剂盒在检测下限、线性范围、可重复性方面均较好，但①检测结果的中位数以 CAP-CTM 最高，artus HBV TM ASR 最低；
  ②检测结果的可重复性以具有全自动 DNA 提取系统的试剂金较好；③所有试剂盒均有假阳性结果，其中使用手工 DNA 提的试剂盒发生率较高。
  鉴于不同方法、不同买验室检测结果之间的差异，欧洲肝病研究会指南特别强调，对治疗过程中 HBV DNA 的随访监测，同一患者需要采取同一种方法。我国有关核苷（酸）类药物耐药预防与管理的专家共识也明确指出，为确保检测结果的稳定性和一致性，对于在同一地方就诊的同一患者，应坚持采取同一种检测方法进行评估。
  HBV DNA 定量检测结果以拷贝／mL 表述较为直观，易于为临床医师和患者理解。但如采用不同厂家试剂盒进行检测，且结果用拷贝 /mL 表述，其差异较大，不便于比较。
  为解决这一问题，由 9 个国家、22 个实验室组成的协作组，对 3 份阳性血清标本采用不同厂家的 HBV DNA 试剂盒进行检测，并将检测结果进行标准化，最后产生一份来自欧洲的“标准血清”（代号 97/746），作为 HBV DNA 核酸扩增检测技术的标准品，定义为 1×10^6 IU/mL（5×10^5／反应管），这一标准已被世界卫生组织 (WHO) 所承认。2006 年，该标准血清被一代号为 97/750 的新标准血清取代。
  各试剂生产厂家如罗氏、雅培、Qiagen 等，均把待测样品的实测值（拷贝 /mL），用 WHO 的标准血清检测结果进行标化后，赋予标准化值，即 IU/mL。
  不同厂家的试剂盒，拷贝／mL 与 IU/mL 的换算系数不同：罗氏公司 CAP-CTM 试剂盒 1 IU/mL=5. 82 拷贝／mL，Qiagen 公司的 ReaIArt HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=6 拷贝／mL，西门子 VERSANT HBV DNA 试剂盒 1 IU/mL=5.7 拷贝／mL，雅培公司实时荧光定量 HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=3. 41 拷贝／mL。
  但为便于临床医师计算，目前国内外相关指南均统一采用 1 IU/mL=5 拷贝／mL 进行换算。需要特别指出的是，目前部分国产试剂盒的报告单位“IU/mL”与“拷贝／mL”的实际换算系数是 1，但为了人为地“与国际接轨”，把报告单位标注成“IU/mL”。

  四、如何看待与处理 HBV DNA 定量检测结果的假阴性与假阳性

  任何检测方法均可能存在假阴性和假阳性。所谓 HBV DNA 定量假阴性是指标本中存在 HBVDNA 却未能检测出来，假阳性是指本来不存在 HBV DNA 却报告检测出阳性结果。
  造成 HBV DNA 定量检测假阴性的常见原因有：①HBV DNA 检测试剂盒灵敏度较低，使 HBVDNA 载量较低的标本漏检；②标本采集、运送或保存不当，导致 HBV DNA 被 DNA 酶降解、断裂；③标本中存在抑制 PCR 过程的物质，如肝素抗凝、血脂过高、溶血等；④HBV DNA 发生变异，致使 PCR 检测的引物、探针与 HBV DNA 靶片段不能有效互补结合，不能形成扩增产物或无法产生荧光信号。
  作者曾接诊 1 例 HBsAg、HBeAg 阳性 CHB 患者，其未曾进行抗病毒治疗，多次在外院查肝功能均示 ALT 升高，但同时多次查 HBV DNA 均 <1×10^3 拷贝／mL，并排除合并其他病因，该医院同期其他患者的检测结果亦未发现异常。后该患者在解放军第四 O 四医院复查 HBV DNA 为 5.6×10^6 拷贝／mL，HBV DNA 测序发现，该患者 HBV DNA 在外院检测时试剂盒所采用的正义 PCR 引物 3 ’末端存在两个碱基的突变。
  造成 HBV DNA 检测假阳性的原因：①标本被污染；②因操作不当或试剂质量等原因导致扩增曲线不平滑、不稳定，在一定热循环数以后扩增曲线出现折线或“翘尾”现象，被系统误检为阳性信号。
  后者可导致一种令临床医师和患者特别困惑的现象，即已长时间抗病毒治疗的患者，突然检测到低水平的血清 HBV DNA，一般在最低检测限左右，如 (1-2)×10^3 拷贝／mL，被误以为病毒学反弹或复发，但立即到不同医院或同一医院进行复检，结果 HBVDNA 低于检测下限。对于此种结果，最好的处理办法是进行重复检测。
  HBV DNA 检测假阳性与假阴性的发现，有赖于临床医师与检验技术人员保持良好的沟通。当临床医师对检测结果有疑问时，应及时向实验室提出，实验室技术人员应采取核对标本是否有误、重新检测、重新抽血、更换检测试剂盒等方法加以复核。

  五、如何看待 HBV DNA 检测与免疫学检测之间的关系

  HBV DNA 定量检测是 HBV 感染的一种病原学诊断手段。与 HBV 感染的传统病原学诊断手段 --HBV 血清学标志物检测相比，其优势是高灵敏度，甚至能发现血清学标志物全阴性的隐匿性乙型肝炎。
  但 HBV 血清学标志物检测有其独特的优势，可提供基因诊断无法提供的信息：①免疫学诊断不仅可以通过 HBsAg 和 HBeAg 来反映 HBV 的存在与否，还能反映机体对 HBV 的免疫应答状态。
  如 HBeAg 的血清学转换提示机体对 HBV 的细胞免疫功能有所好转；如单独出现 HBeAg 的消失而不伴有抗 -HBe 的出现，则主要反映病毒被抑制而不是免疫功能的好转；如继续出现 HBsAg 的血清学转换，代表机体对 HBV 免疫功能的显著好转或痊愈。
  ②免疫学诊断可为基因诊断提供补充信息和线索。例如，同样是未经治疗的 HBV DNA 载量为 1×10^6 拷贝／mL 的两例 CHB 患者，如果一例 HBeAg 阳性，而另一例 HBeAg 阴性，则预示着患者的 HBV DNA 可能存在前 C 区和（或）基本核心启动子区基因变异。
  ③免疫标志物检测可作为抗病毒疗效评价的补充手段。有研究显示，在干扰素治疗 CHB 过程中，HBsAg 定量的快速下降是 HBeAg 阳性 CHB 患者 HBeAg 血清转换的预测因子，对 HBeAg 阴性 CHB 实现治疗后持久病毒学应答 (sustained virological response, SVR) 和 HBsAg 消失也有很好的预测作用。
  因此，我国的相关专家建议中，明确提出把 HBsAg 定量和 HBV DNA 的动态变化作为应答指导治疗 (response guided therapy，RGT) 策略的主要预测、指导指标。
  ④血清 HBsAg 和 HBeAg 检测对肝细胞癌有一定的预测作用。中国台湾一项对初治、无肝硬化的 2 688 例患者进行平均 14.7 年的随访研究显示，HBeAg 阳性、高载量 HBV DNA 均与肝细胞癌的高发病率相关。
  HBsAg 也与肝细胞癌风险具有量效相关性。特别是对于 HBeAg 阴性、低血清 HBVDNA 载量者，HBsAg≥1 000 IU/mL 者发生肝细胞癌的风险是 HBsAg<1 000 IU/mL 者的 5.4 倍。作者认为，在预测肝细胞癌方面，HBsAg 水平可作为 HBV DNA 的补充。

  六、结语

  HBV DNA 定量检测应用于临床后，不仅是一种检测技术，更是一种诊断手段。要在临床上正确应用 HBV DNA 定量检测，临床医师首先需对检测结果的临床价值有正确的认识，并据此进行相应的临床决策，如是否需进行抗病毒治疗或进行 HBV 宫内感染阻断、是应答不佳还是已发生耐药、进展至肝硬化或肝细胞癌的风险等。
  其次，临床医师还需对 HBV DNA 定量检测技术本身有所了解，如荧光定量 PCR 检测的基本原理及其不同于其他检验技术的基本特点（扩增能力强、灵敏度高，但同时检测结果波动大、室间差异大）等。
  对本单位所采用的试剂盒的灵敏度、线性范围等则需有恰当的评价，不能为说明书所左右。再次，临床医师还需将 HBVDNA 检测与其他诊断手段相结合，并与检验技术人员保持有效的沟通，才能对患者的病情做出正确的、全面的评价，避免错误的诊断乃至错误的治疗。
  总之，临床医师只有不断更新专业知识，不断加深对 HBV 基因诊断技术的理解，并正确和合理地应用于临床实践，才能造福于广大乙型肝炎患者。（转化医学网360zhyx.com）