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腾讯登录Cell子刊：用CRISPR等技术实现iPS细胞治疗
| 导读 | 来自京都大学iPS细胞研究和应用中心(CiRA)的研究人员证实，可以利用诱导多能干(iPS)细胞来纠正导致杜氏肌营养不良（DMD）的基因突变。 |
来自京都大学iPS细胞研究和应用中心(CiRA)的研究人员证实，可以利用诱导多能干(iPS)细胞来纠正导致杜氏肌营养不良（DMD）的基因突变。这项发表在《Stem Cell Reports》杂志上的研究，用实例演示了如何利用诸如CRISPR和TALEN一类的工程核酸酶，来编辑由DMD患者皮肤细胞生成的iPS细胞的基因组。这些细胞随后分化为了骨骼肌，在这些肌肉中导致DMD的突变消失了。
DMD是由dystrophin基因中一种功能缺失突变所引起的严重肌肉退行性疾病。每3500名男孩中就有一人发病，患者通常到成年早期即死亡。当前除了姑息疗法患者能够获得的治疗非常少。获得人们关注的一种选择方案就是借助于TALEN和CRISPR来进行基因组编辑。这些酶已迅速成为分子生物学中的宝贵工具。它们使得科学家们能够在特异位点切割基因，然后改变残留部分生成他们感兴趣的基因组序列。然而，可编程的核酸酶并非无懈可击，它们往往会错误地编辑与靶序列相似但又存在几个碱基对差异的序列，由于有导致有害突变的可能性，使得它们无法可靠地应用于临床。出于这一原因，iPS细胞是一种理想的模型，因为它们可为研究人员提供丰富的患者细胞来测试可编程核酸酶，寻找最佳条件来将脱靶修饰减至最少。CiRA的科学家们利用了这一特性，他们生成了来自一名DMD患者的iPS细胞。随后利用几种不同的TALEN和CRISPR修正了这些iPS细胞的基因组，这些iPS细胞之后分化成为了肌肉细胞。在所有情况下， dystrophin蛋白的表达均得到恢复，在某些情况下，dystrophin基因得到了完全纠正。
取得这一成功的关键在于研究人员开发出了一种计算方案来将脱靶编辑的风险降至最小。该研究小组构建出了一个数据库，列出了长达16个碱基对的序列所有可能的排列。他们从中挑选出了只在人类基因组中出现一次的独特序列。DMD可以由几种不同的突变引起；本研究中患者的DMD是由于44号外显子删除所导致。
研究人员因此构建出了在包含这一外显子的基因组区域中出现的一些独特序列的直方图。他们在第45号外显子中发现一堆独特序列。该项目的负责人、京都大学CiRA和整合细胞-材料科学研究所的Akitsu Hotta说：“近一半的人类基因组都是由重复序列组成。因此即便我们找到了一条独特序列，一个或两个碱基对的改变都有可能造成其他的重复序列，带来在错误区域进行TALEN或CRISPR编辑的风险。为了避免这一问题，我们找到了一个在这一直方图中居高的一个区域。”
有了这一靶标，该研究小组想到了三种策略来修正dystrophin基因的移码突变：通过连接第43号和46号外显子达到外显子跳跃（exon skipping）修复阅读框；通过掺入插入突变或缺失（indel）突变来实现移码，以及在第45号外显子之前插入第44号外显子来敲入外显子。所有三种策略均有效地提高了分化骨骼肌细胞中的dystrophin合成，但只有外显子敲入方法将基因恢复至了自然状态。重要的是，编辑显示出非常高的效率，表明他们的计算方法可以将编程核酸酶介导的脱靶编辑降至最低
并且，该篇论文还提供了原理证明：利用iPS细胞技术结合TALEN或CRISPR可以治疗DMD。现在该研究小组的目标是将这一方案扩展到其他疾病。第一作者Lisa Li解释说：“我们证实了TALEN和CRISPR可用来纠正DMD基因突变。我希望可以将这些核酸酶应用于纠正其他遗传疾病如点突变一类的突变。”（转化医学网360zhyx.com）
原文：Precise correction of the DYSTROPHIN gene in Duchenne Muscular Dystrophy patient-derived iPS cells by TALEN and CRISPR-Cas9. Stem Cell Reports
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