【干货】肿瘤的分子病理诊断

  分子生物学理论、方法出现的革命性创新并日臻完善，使生物医学进入分子时代，也将病理学带入分子病理学时代，对疾病的病因、发生、发展、发病机制及形态变化，从传统形态学概念深入至分子或基因水平，其中以癌基因、抑癌基因及其他相关基因研究为代表的肿瘤分子病理研究是最为热点的领域，分子诊断成为肿瘤病理研究的最主要的内容和手段，近十余年，分子诊断已由实验室逐步进入应用阶段，分子诊断的特点是灵敏度高、特异性强、适用范围广，取材一般不受组织或时相限制，具有广泛的应用前景，在肿瘤分子病理研究中正展示其重要价值。本文就肿瘤分子诊断的应用和检测方法作一简述。

  1 分子诊断在肿瘤研究中的意义

  1.1 肿瘤易感基因的检测：肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛检具有实用价值，已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有Rb1(视网膜母细胞瘤)、WT1(肾母细胞瘤)。p53(Li-Fraumeni 综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、NF1(神经纤维瘤病)、VHL(VonHippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征)、BRCA(家庭性乳腺癌、卵巢癌)等。除了检测高危人群的易感基因外，有方法也应用于正常人群肿瘤易感性检测，如检测Ret基因突变用于诊断Ⅱ型多发性内分泌肿瘤，通过分析GST基因型以判断个体暴露于致癌物时的致癌危险性等。

  1.2 肿瘤的分类：判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源，应用RFLP分析免疫球蛋白或T细胞受体基因重排，具有鉴别诊断作用，且这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。对Bcr区基因重排的检测，可对慢粒和急粒进行鉴别诊断。N-myc和C-myc扩增和表达的检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值，因前者N-myc明显扩增，而后者则为C-myc明显扩增。

  1.3 肿瘤的早期诊断：K-ras基因突变是一种胰腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤中发生率较高的分子事件，突变集中在第12、13和61编码子。应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌的第12编码子变突，检出率可达100%，应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中的Ras基因突变，其检出率与瘤组织中相似，可用于高危人群的筛选。

  1.4 肿瘤的预后判断：肿瘤基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关，如p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关，nm23的状态则与肿瘤转移相关。研究发现从分子水平上判断肿瘤的生物学行为及预后具有较高的准确性。如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化，提出了结肠癌癌变和演进的分子模型，阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征。此外，文献中对胃癌、肝癌、肺癌等也提出了类似的分子模型。

  1.5 肿瘤的预后监测：分子诊断在肿瘤的监测方面也具有重要的作用，如临床治疗缓解期内白血病的白血病细胞仍达1011，用细胞遗传学方法检出率约为1%～5%，应用核酸杂交技术灵敏度可达0.15%～0.05%，而PCR技术则可使检出率达到10-6左右。提高了对肿瘤转移、复发监测的准确性，有助于及时采取适当的治疗措施

  1.6 为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据：肿瘤发生、发展的不同时期，可能涉及不同基因的不同变化形式，而基因的变化及基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关，如能在分子水平对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺癌中存在Ras基因的激活，50%左右的肿瘤有p53基因不同形式的突变，这些基因的异常，使肿瘤对某些放疗或化疗的方法具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放、化疗的敏感性。

  2 分子诊断在肿瘤研究中的应用

  2.1 基因过表达的检测：癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中的关键因素。癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为重要形式之一，可表现为mRNA和蛋白质量的增加，此外，基因扩增可表现为基因拷贝数的增加，这些基因表达的异常，均可加以检测。

  2.1.1 表达产物的检测：蛋白质水平基因表达产物的检测最常用的方法为免疫组化技术，也可应用酶联免疫吸附和Western蛋白印渍法。新一代测定方法为流式细胞仪法(flow cytometry),更新的影像细胞测试法(image cytometry)则可应用特定波长的光密度进行积分，进行特定蛋白质的定量分析。

  2.1.2 基因扩增的检测：基因扩增主要表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，经典方法为DNA和RNA和印渍杂交。但应用更普遍的为组织细胞原位核酸分子杂交，包括原位杂交、荧光原位杂交、对比基因组杂交。近年发展较快的荧光原位杂交和对比基因组杂交在肿瘤分子诊断中具有重要的应用价值。原位PCR技术作为一种敏感性高、特异性强、能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的研究方法，在分子诊断中发挥了重要作用，其灵敏度比原位杂交高出2个数量级，是形态学和分子生物学前沿交叉的产物，对前沿研究和学科发展起着巨大作用。Anderson曾在1994年生动地指出“原位PCR使光学显微镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸。”

  2.2 基因突变的检测：癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生中出现频率较高的分子事件，不仅在肿瘤细胞中可检测到突变基因，在一些癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存在不同形式和程度的基因突变，基因突变的检测对研究肿瘤发生机制、诊断和鉴别诊断、预后评估及治疗方案选择等都有重要价值。基因突变形式主要有点突变、基因缺失(1～2个碱基缺失，一个片段或一个外显子缺失)、基因易位或重排、基因插入、甲基化及染色体非组蛋白改变等。

  基因突变及其检测方法研究已成为生命科学研究的热点。1985年以前，主要应用Southern杂交，可筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式，对于不能用该法检测的突变，也可用NDA序列测定分析，但复杂费时。促进了基因突变检测技术的发展，目前大部分基因突变检测技术都是以PCR为基础，已达20余种，比较成熟的技术包括PCR-SSCP法、杂合双链分析法、突变体富集PCR法、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶反应、等位基因特异性扩增法、RNA酶A切割法、荧光原位杂交、寡核苷酸引物原位DNA合成法、比较基因组杂交法和DNA序列分析等。

  2.3 限制性酶切片段长度多态性分析：通过对DNA分子的分析识别特定基因组区域的丢失及扩增，其中较重要的一种研究为应用同一个体的正常体细胞(血细胞或瘤旁正常组织)及肿瘤细胞的DNA，检查DNA多态性座位上等位基因的不平衡性，当两个等位基因的相关性密度在正常与肿瘤细胞之间出现显著性差异时，就提示肿瘤细胞中多态性序列座位处出现突变，当DNA序列的差异发生在限制性酶识别位点或当DNA片段插入、缺失或重复，可使基因组DNA经限制性内切酶水解发生片段长度改变，在不同个体间可出现不同长度的限制性片段类型，故称为限制性酶切片段长度多态性(RFLP)。RFLP技术可直接分析癌组织中某些基因在染色体上的变异及其与肿瘤发生的关系，精确位点的RFLP分析还是发现新的肿瘤基因的有效手段。目前能用于RFLP分析的肿瘤基因探针和基因位点探针已有数百种，覆盖了人类23对染色体，是肿瘤分子诊断的重要方法之一。

  2.4 微卫星不稳定性分析：微卫星不稳定性检测是基于数量可变串联重复序列(VNTR)的发现，细胞基因组含有大量碱基重复序列，一般将6～70 bp的串联重复称为小卫星DNA或VNTR，1～4 bp的串联重复称为微卫星DNA或简单重复序列(SRS)，SRS为新的DNA多态性标志之一。微卫星不稳定性(MI)是指SRS的增加或丢失，特别是在DNA错配修复系统缺损的肿瘤基因组中，常显示大量MI。MI仅在瘤细胞中发现，目前已发现存在于肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤组织。检测MI方法为PCR扩增及电泳分析，如结合显微切割技术，则可使检测目的更为明确。

  2.5 端粒酶及其检测：端粒酶与肿瘤关系的研究是近年来十分活跃且发展迅速的领域之一，近年的研究表明，人类肿瘤中85%左右的肿瘤细胞存在端粒酶活性表达，对端粒酶的研究有可能为肿瘤的发生发展、诊断、预后等提供指标，并可能以抑制端粒酶表达为手段作为肿瘤治疗的新方法。

  端粒酶活性检测经典方法为端粒重复扩增技术(TRAP)，TRAP法分析结果是非线性的，样品间的比较和定量比较困难，且操作复杂，也不适用于小样品，而且由于有些组织中含有Taq酶抑制物，会出现假阴性结果，目前不少研究者致力于端粒酶检测方法的改进，有人应用接近闪烁分析技术，在96孔板上进行TRAP操作，可用作大规模临床样本及端粒酶抑制剂的筛选。ELISA法是利用端粒酶在生物素标记的引物上加入多个6核苷酸端粒重复序列，反应产物用生物素标记的引物进行PCR扩增，与地高辛标记的探针杂交，再与抗生物素蛋白包被的微量滴定板结合，该法省时且无放射性污染，可减少假阴性。原位杂交法检测端粒酶活性也有报道，有可能通过原位杂交区分正常和肿瘤细胞，但仍有待于进一步的成熟，稳定。

  3 肿瘤分子诊断的发展前景及其标准化

  分子诊断技术是肿瘤分子病理研究具有划时代意义的检测手段，拓宽了病理学研究的范围，使我们对肿瘤发生发展、形态特征、生物学行为的认识进入分子水平，分子诊断的大部分技术已日趋成熟，但目前还主要用于研究领域，真正用于临床检测的技术开展得还比较少，费用昂贵、操作复杂是重要原因，分子诊断技术也不能完全取代许多目前使用的行之有效的实验室诊断方法。肿瘤病理诊断仍应坚持以形态学为基础的原则，分子诊断只是这些方法的补充、改善和提高。

  分子诊断目前仍存在一些问题，由于其技术一般都具有敏感性高的特点，特别是PCR技术，结果影响因素较多，最大的问题为技术性假阳性和假阴性，PCR技术本身已比较成熟，要使检测技术具有高敏感性，又要确保检测结果的高特异性和重复性，质量控制至关重要，关键在于建立标准化的实验操作程序和标准化的分子诊断实验室，除诊断技术方面的标准化外，诊断指标也要实行标准化，这样才有可能对肿瘤的诊断、鉴别诊断、浸润转移、临床治疗方案的选择及生物学行为的评估等方面提供有意义的指标，这将是每位病理学家所面临的机遇和挑战。

  作者简介：朱明华(1952—)，男，教授，博士生导师，第二军医大学病理学教研室主任，长海医院病理科主任，曾在美国NIH工作数年，承担国家及军内多项重点研究项目。