【精华】甲状腺癌分子诊断和靶向治疗最新进展综述

  引言

  甲状腺癌（TC）是最常见的内分泌腺恶性肿瘤，近几年发病率显著上升。在发达国家，年龄标准化甲状腺癌(TC)发病率为每十万个女性中有9.1个患TC，每十万个男性中有2.9个患TC。TC病理分型包括：甲状腺乳头状癌（PTC）、甲状腺滤泡状腺癌（FTC）、甲状腺未分化癌（ATC）及甲状腺髓样癌（MTC）。PTC和FTC属于分化的甲状腺癌（DTCs），占总甲状腺癌的90%。

  诊断上，细针穿刺细胞学检查（FNA）是当今评估甲状腺结节最可靠的手段。然而 FNA无法明确诊断20%-30%的甲状腺结节，此种案例被报道为良恶性不确定。由于对此类结节缺乏可靠的诊断手段，大部分患者接受诊断性手术来确定结节的病理。如果术中甲状腺叶切除术标本显示癌灶大于 1cm，需要二次手术完成甲状腺全切术。

  因此，术前获得一种准确的诊断手段，就可以避免不必要的手术和二次手术。这就需要一种新的基于分子生物标记的诊断方法。在治疗上，大部分案例放射性碘 131治疗后施行手术切除是一种典型的治疗方法并可以获得很好的预后。但是，对于手术不能治愈及放射性碘 131抵抗的分化型癌（DTCs）、髓样癌（MTC）和未分化的甲状腺癌（ATC）并没有标准化的治疗方法，由此是成为导致 TC死亡最主要的病因。

  实际上，在过去的几年一直有报道甲状腺癌与体细胞突变、基因表达、微小 RNA表达及基因启动子甲基化相关。基于当前正致力于研究更有效解决甲状腺癌的治疗方法，遗传学改变正好为甲状腺癌在新的诊断、预后分子标记以及治疗靶点的研究方向上提供了一个前所未有的机会。此篇综述的目的是：从临床视野总结现今甲状腺癌的医疗水平，重点阐述分子诊断及靶向治疗的最新进展。

  分子诊断

  甲状腺癌（TC）的发生是一系列遗传和表观上的改变，包括：体细胞突变的激活及失活、基因表达模式的改变、微小 RNA调节异常和基因异常甲基化。大部分都为体细胞突变，其中包括：点突变和染色体改变。在此部分，涉及到了常见的基因变异及对其对 TC处理上的影响，也提及了相关分子诊断技术。

  1、遗传学改变

  有文献报道了，甲状腺癌的遗传学改变包括：丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路及磷酸肌醇 -3-激酶（PI3K）/AKT信号通路。在这些非重叠的遗传学改变中，70%的甲状腺乳头状癌（PTCs）证实发现了BRAF、RAS、RET/PTC癌基因；70%的甲状腺滤泡癌（FTC）证实发现了 RAS及 PAX8/PPARc癌基因；低度分化及未分化癌中可见 TP53 及 CTNNB1癌基因。
  无论是家族性还是分散性的甲状腺髓样癌（MTC）在 RET基因或者 RAS基因上常发生点突变。这些突变基因的标记、基因表达的改变及微小 RNA谱已经在甲状腺结节的诊断中探讨了其作用，其中一些已在临床上得到应用。BRAF是研究最多的癌基因之一，也是甲状腺癌遗传学改变最常见的突变基因。

  2、BRAF基因点突变

  BRAF编码的蛋白是丝氨酸 -苏氨酸激酶，其由 RAS蛋白激活并转运结合到质膜后可以改变细胞的位置。甲状腺癌 BRAF基因通过点突变而被激活。最常见的是第 1799位单个碱基错义突变（T1799A）导致翻译蛋白质第 600位密码子的缬氨酸（Valine）被谷氨酸（Glutamate）替换，成为活化蛋白质激酶（BRAF V600E)。其中甲状腺癌 BRAF 突变有 99%为 BRAF V600E突变。乳头状癌遗传学改变中最常见的类型就是 BRAFV600E氨基酸置换且 40%-45%的肿瘤已被确认会发生 BRAFV600E突变。
  在典型的乳头状及高细胞甲状腺癌、1/3的髓样癌和未分化癌中都被证实有 BRAF基因突变。去分化型拥有分化型甲状腺癌的特点（如两者都包括 BARF基因突变），这说明分化型可以进展为去分化型。一项多学科的研究表明，BRAF与淋巴结转移，甲状腺外扩散，疾病晚期（III期和 IV期）及癌复发密切相关。之前还认为，BRAF基因突变与 PTC复发后与放射碘亲和力的缺失密切相关，致使放射性碘 131治疗抵抗。此项发现也被其他研究所证实。
  普遍认为，BRAF基因突变会导致很多肿瘤促进分子的过度表达，比如血管内皮生长因子（VEGF）及肝细胞生长因子（MET）。在国际多中心学科中，研究结果也说明了 BRAF基因突变与甲状腺乳头状癌死亡率密切关系。一项基于前瞻性研究的 Meta分析报道了超过 5000份甲状腺细针穿刺标本的最终病理及 BRAFV600E蛋白检测的结果，最终显示 BRAF基因突变将导致 99.3%患癌风险。
  鉴于 BRAF基因突变与 PTC的易转移性及癌症复发后放射碘亲和力缺失密切相关，因此手术根治切除突变阳性的癌灶很重要。在本文中，比如对于微小乳头状癌（小于或者等于 1mm）术式的选择上，美国甲状腺协会推荐应该施行甲状腺腺叶切除，但是如果术前检测BRAF显示阳性，推荐甲状腺全切才安全。
  另外，大于5mm的微小型甲状腺乳头状癌也推荐全切，因为大于5mm比小于5mm的甲状腺癌复发率将明显提高。因为基于多种敏感性和特异性的PCR扩增技术，术前细针抽吸细胞学样本检测BRAF的方法（比如比色法检测突变试验）简单可行。
  鉴于 BRAF基因突变与 PTC复发（甚至是低危癌复发）之间的密切关系，因此术前检测对于常规显示低危但BRAF基因突变阳性的患者判断复发更具有意义。因此，建议临床医生处理这些患者时可通过放射碘消融正常的甲状腺组织以提高甲状腺球蛋白（TG）检测的可靠性。
  此外，检测 BRAFV600E 是预测中央区淋巴结转移的一项相当可靠的方法。因此术前检测 BRAFV600E结果显示阳性的甲状腺乳头状癌患者比首次广泛切除更有益处。随机化临床试验一直在研究是否预防性施行 PTC中央区淋巴结清扫会提高患者预后，但是术前检测 BRAF将会对扩大切除甲状腺及淋巴结的范围做出指导。
  另外，BRAFV600E通过基因调控肿瘤基础微环境以触发肿瘤的浸润及转移，从而对 PTC进展到 ATC中起重要的作用。此外，甲状腺癌患者检测 BRAFV600E可以为潜在肿瘤的进展及将来是否使用选择 BRAFV600E靶向治疗阻滞剂提供重要的信息。总之，以上的研究表明，放射碘 131抵抗及手术不能够治愈的甲状腺癌患者可适用于抗 BRAFV600E疗法。
  已经有文献报道，对于早期甲状腺癌与微小癌中 BRAFV600E和疾病高侵袭性特点之间存在关联。已运用BRAF基因变异联合其他导致不利预后的因素（如年龄、特殊病理类型）对甲状腺微小癌及癌症大者进行危险分级。这将对甲状腺癌患者将来个体化手术治疗及术后管理带来益处。

  3、RET/PTC基因重排

  尽管甲状腺乳头状癌可能在第 10号染色体上隐匿 RET/PTC1及 PTC3基因重排，但是 RET基因被认为在髓样癌中与种系或者体细胞突变最为密切相关。平均 20%的相关文献表明此种基因重排具有高度变异性。异质性可能归因于检测敏感性的变异度及细胞克隆的差异。在临床上，RET/PTC基因变异与因年轻或者辐射暴露而患癌相关。
  组织学诊断上来讲，RET/PTC1在典型的甲状腺乳头状癌中常见；而 RET/PTC3在罕见的实性亚型中常见，这是一种有争议但具有高度侵袭性的由不同基质包围的实性层状细胞组成的组织亚型。从预后方面来讲，RET/PTC1与淋巴结转移相关；但是，变异与肿瘤演化为低分化或者未分化不相关。
  已经在细胞学样本中通过单项测试及更大型的分子面板证实了RET对诊断的作用 --RET 的使用对形态学不确定的标本提供益处。对于一个细胞学不确定的标本，如果 RET显示阳性就需要甲状腺全切（如同 BRAF阳性）。由于 RET与典型变异 PTC的区域淋巴结转移相关，故 RET阳性对判断预后提供益处（如同 BRAF阳性）。

  在一个多机构研究中，97例 PTC患者比较了遗传学改变 (BRAF, RET, RAS）、组织形态学、临床表现及预后特点。作者发现，RET基因重排与区域淋巴结转移高发呈正相关，BRAF与高肿瘤分期相关，RAS与低危的滤泡型乳头状癌相关。

  4、RAS点突变

  FNAB细胞学未明确的标本常是因为 RAS基因发生了突变。RAS基因包括 HRAS、KRAS、NRAS及特定密码子核苷酸置换。RAS在细胞膜上编码 G蛋白从而 G蛋白在激活酪氨酸激酶 /MAPK通路。在大部分人类肿瘤中都隐匿着 RAS基因中 KRAS基因第 12/13位密码子的点突变，而甲状腺肿瘤通常存在 NRAS第 61位密码子点突变或者 HRAS第 61位密码子点突变。
  由于 RAS在甲状腺良恶性肿瘤都存在，因此限制了其在诊断中的运用。45%的滤泡型乳头状癌和 26%的滤泡性癌都存在 RAS基因突变。在滤泡状腺癌中，囊性肿瘤 RAS常阳性，浸润性肿瘤 RAS常阴性。这表示 RAS与肿瘤惰性相关。另外在低分化及未分化癌甚至是髓样癌中均发现了 RAS，这显示了 RAS与这些肿瘤的侵袭性临床病程相关。RAS可作为癌细胞亚型的一个标记，可以显示形态学分化良好但已有潜在转移及去分化的癌灶。
  在连续检测甲状腺 FNA样本中，RAS突变是第二大常见的变异类型并具有重大的诊断意义。在少数前瞻性研究中显示，RAS突变对诊断恶性具有 74%-88 %阳性预测值。在甲状腺结节中检测 RAS基因突变虽不能确定恶性诊断，但可以为诊断肿瘤提供了有利凭证。检测 RAS基因作为一种标记滤泡型乳头状癌癌细胞，它的重要性在于其他方式难于判断结节性质，尤其是 FNA细胞学难于诊断时。但有些 RAS阳性的结节最终诊断为良性滤泡状肿瘤，这就导致了假阳性率。

  5、PAX8/PPARc基因重排

  PAX8/PPARc基因重排是第2号染色体q13与第3号染色体p25发生了异位。PAX8/PPARc基因重排是FTC中继于RAS后第二大常见的遗传学改变，大概占FTCs的30%-40%，占甲状腺Hu¨rthle 癌的5%。在临床上，FTCs中PAX8PPARc阳性多发生在年轻患者。此种变异与滤泡状原位/浸润前癌的关系尚未清楚。只检测PAX8PPARc重组阳性不能诊断为恶性。在组织学或者细胞学样本中检测PAX8PPARc对进一步的诊断分析提供了暗示。

  6、分子诊断技术

  临床实验室里有很多方法允许在几种样本中检测分子的变异。样本包括但不局限于血液、 口腔试子样本、新鲜速冻组织、FNA活组织样本及福尔马林固定石蜡包埋组织。临床实验室中常用的分析技术包括：DNA测序、免疫细胞化学 (ICC)、荧光原位杂交、PCR和许多相关 PCR技术的延伸包括逆转录 PCR、实时 PCR、聚合酶链反应单链构象多态性分析。分析候选蛋白标记物的 ICC技术虽然在技术上的变化会引起结果解释的差异，但是因价格便宜成为是一种受欢迎的诊断手段。
  半乳糖凝集素 3（GAL3）是最多研究的标记物，它与细胞粘附、细胞周期调控、细胞凋亡及肿瘤进展相关。一项 Meta分析显示，最常用于检测单一标记物额 ICC技术检测 GAL3时显示出了最高的敏感性（85%）及特异性（90%）。每种检测方法必须调整以适应满足诸如病理学、内科内分泌学及外科学等临床服务的需要。

  靶向治疗

  在最近大多数临床试验和 Meta分析中均表明，新的分子靶向药物对放射碘 131治疗抵抗及手术不能治愈的甲状腺癌的疗效显示前景广阔。在史无前例的分子甲状腺癌医学时代中，这些新颖的基于分子的处理甲状腺结节和 TC的疗法是最令人兴奋的进展。分化型甲状腺癌靶向治疗的研究包括：靶向 VEGF通路、新靶向 MAPK通路及新靶向 PI3K通路。在此文中讨论了研究最多的靶向药物。

  1、索拉菲尼

  索拉菲尼是一种同时靶向于 VEGFRs、 RET/PTCs及 BRAF的口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。2013年 12月 22号美国食品及药物管理局（FDA）批准索拉菲尼为治疗局部复发或者转移、放射碘抵抗的进展期DTC（400mg，一日两次）。此次批准是基于一项受试对象一共 417名的多中心、双盲、安慰剂对照的 III期临床试验的最终结果。
  最近一项关于研究索拉菲尼对 DTC、MTC及 ATC疗效的系统回顾表明，部分缓解率、次稳定率及次进展率分别是 21%、60%及 20 %。另外，占 16%的患者因药物毒性及患者不耐受中止治疗，剂量也进一步降低了56%。与次进展无关的死亡率大概为 4%。
  我们也成功完成了低剂量（200mg，一天两次）索拉菲尼治疗甲状腺癌肺和脑转移的两项研究，结果尤其显示有助于治疗对药物耐受性差及放射碘 131治疗抵抗的 DTC。我们的研究吸引人的地方不仅在于缓解经济负担而且还降低不良反应的发生率及严重性。

  2、帕唑帕尼

  帕唑帕尼也是一种酪氨酸酶抑制剂（TKI）。该药经过了美国国家癌症机构赞助的受试对象一共是 37位分化型甲状腺癌患者的无对照多中心 II期临床试验。
  反应率在滤泡癌及 Hurthle 细胞癌中显示较高，分别是 73%、45%；在乳头状癌中显示较低，为 45%。一年无进展生存期和总生存率分别是为 47%及 81%。但是，最近一项关于帕唑帕尼单药治疗 ATC的多中心 II期临床试验的最终结果令人失望。该试验一共 15名受试对象，结果没有一名显示有确切的疗效。因此作者得出结论：单独使用帕唑帕尼几乎没有疗效，可能在联合药物疗法中起一定的作用。紫杉醇和帕唑帕尼联合与安慰剂对照的进一步的研究正在进行，用来补充多中心 II期临床试验结果的不足。
  同时，有一项研究报道了帕唑帕尼联合微管抑制剂如紫杉醇通过加强抑制有丝分裂对未分化型甲状腺癌细胞和异种移植能够提高及协同抗癌的疗效。此研究表明，帕唑帕尼联合紫杉醇疗法治疗未分化型甲状腺癌（ATC）是一种有希望的候补疗法，同时极光激酶 A对 ATC也具有潜在可行的靶向分子治疗疗效。
  在此基础上，一项放射治疗肿瘤组（RTOG）随机临床试验已设计出并施行，在调强颈部放射疗法的基础上旨在比较紫杉醇单独疗法与紫杉醇联合帕唑帕尼疗法的疗效 (ClinicalTrials.gov identifier NCT01236547)。

  3、凡德他尼

  凡德他尼是一种口服的小分子多靶点酪酸激酶抑制剂 (TKI),可同时作用于肿瘤细胞 VEGFR-1、VEGFR-2和RET。 2011年 4月，凡德他尼成为第一个被 FDA批准的治疗症状性或者进展性甲状腺髓样癌。此次批准是基于一项国际的随机化、双盲、安慰剂对照 III期临床试验的最终结果。
  在此 III期随机临床研究中，331名受试对象按 2:1随机化分为两组，其中大组接受凡德他尼，另一组接受安慰剂治疗。此研究的首要观察终点是比较两组延长的无进展生存期。次要观察终点包括客观反应率、总死亡率、生化反应 (CT and CEA降低 )及疼痛加剧的时间。主要的结果和不良反应见表 1中。
  最近的一项研究凡德他尼治疗癌症患者的 Meta分析表明，non-TC组 QT间期延长的发生率与重度级别分别是16.4 %和 3.7 %：TC组 QT间期延长的发率生与重度级别分别是 18.0 %及 12.0 %。

  4、Cabozantinib (XL184)

  Cabozantinib是一种口服的小分子多靶向治疗药物，可同时作用 VEGFR-1及 VEGFR-2、 MET 还有 RET，其半数最大抑制浓度分别是 5.2 ± 4.3, 0.035 ± 0.01,和 1.3 ± 1.2 nmol/L。2012年 12月 Cabozantinib被FDA批准为治疗进展期转移性甲状腺髓样癌的药物。
  2013年 1月 Exelixis公司宣布了，欧洲药物管理局（EMA）已经通过了对 Cabozantinib治疗进展期、不能切除、局部高级别或者转移的甲状腺髓样癌的营销批准的申请。批准 Cabozantinib是基于一项随机化、双盲、安慰剂对照 III 期国际临床试验。
  Cabozantinib对甲状腺高级别髓样癌的疗效在一项队列研究及延长的 I期临床试验中因显著抗肿瘤活性所被证实。因为研究纳入了 330名按照实体瘤疗效评价标准经 14个月的筛选证实为进展期、不能切除、局部高级别或者转移的甲状腺髓样癌受试对象，因此此项 I期临床试验中又包括了一项队列研究。

  5、Lenvatinib

  Lenvatinib是一种口服的选择性受体酪酸激酶抑制剂 (TKI),可同时作用于肿瘤细胞 VEGFR-1及 VEGFR-3、FGFR1–4、 PDGFR-b、 KIT和 RET，从而影响血管生成及肿瘤增殖。

  2014年 2月 2日卫材 (Eisai)公司公布了实验性抗癌药物 lenvatinib Ⅲ期 SELECT 研究达到主要终点的数据。与安慰剂组相比，lenvatinib在治疗放射性碘 131抵抗的分化型甲状腺癌的疗效上显示有高度显著的统计学意义。基于这些临床结果，卫材 (Eisai)将会向美国、日本及欧洲卫生当局呈交批准营销 lenvatinib的申请。
  关于甲状腺癌靶向治疗还有很多问题尚未清楚。比如什么时间使用这些靶向药物，是否提高了总体生存率，什么时候顺序给药，什么时候联合给药，是否这些靶向药物可够恢复放射碘治疗的敏感性？在适合使用靶向药物的患者中生物标记和分子诊断的作用尚不清楚。由于现在没有充足的直接研究比较，因此是否其中一种比其他所有的靶向药物作用显著也尚未可知。

  结论

  运用新兴的分子标记技术有望显著提高甲状腺结节诊断的准确性，同时对个体化手术及术后管理提供益处。研究现状表明甲状腺癌新颖的靶向治疗是一种有前途的方向，由此倡导进一步的研究和调查。分子诊断指导的靶向治疗的启蒙研究应该被批准。
（转化医学网360zhyx.com）