单细胞分析在循环肿瘤细胞研究中的应用

  循环肿瘤细胞（CTCs）是近些年来癌症研究的热点之一。这些在实体肿瘤患者血液中发现的微量细胞可能在肿瘤的转移过程中发挥关键作用。过去，由于数量稀少以及白细胞污染等原因，CTC转录谱研究受到了很大的限制。单细胞分析的出现使这些问题迎刃而解，把CTC的研究推到了一个新的深度。

  如果要对CTC进行单细胞分析，首先要做的就是CTC的分离。除了用最经典的磁珠富集、流式分选的办法以外，很多研究小组还开发了专门用来获取单个CTC的技术。斯坦福大学的Jeffrey等人发明了一种基于EpCAM磁珠的MagSweeper的技术，可以直接从病人全血中分离出CTC细胞；该成果发表在2012年的Plos One杂志上；哈佛医学院的Mehmet Toner实验室开发了基于微流控技术的CTC-iChip，其原理是通过细胞大小区分和除去红细胞和血小板，然后再利用磁场引导标有磁珠的CTC细胞的路径，从而实现CTC和白细胞的分离。

  这些策略均实现了CTC的提纯，但是要想获得单个细胞则需要手工进行挑取。单细胞的挑取和样品手工制备是一项细致、专业性很强的工作，稍有不甚就会挑到多余的细胞或者使细胞受到损伤。另外，单细胞所含的核酸样本极少，对如此微量的样本进行操作也有不小的挑战。目前，已经有集成的仪器系统可以完成这些处理过程，这就是目前在国内外很多实验室中正在使用的C1 单细胞自动制备系统。该系统用微流控技术实现了单细胞的捕获以及后续的细胞裂解和核酸扩增。所有步骤都是在C1微流体芯片中一系列纳升级的反应仓中进行。除了利用标准的反应程序，用户还可以根据自身的实验设计设计程序，具有很高的灵活性。目前C1已经可以实现单细胞基因组、转录组的扩增，以及特定基因的预扩增。

  更加集成化的技术还在不断涌现。2015年2月底，Fluidigm公司在GABT会议上推出了Polaris系统。该系统全面集成了单细胞分选、捕获、培养、给药以及核酸样品制备，把整个样品制备流程集成在一块微流体芯片中自动完成。这对于CTC的研究具有非同一般的意义，研究者可以直接把荧光标记好的病人外周血样本加到系统中，系统就可以自动的把48个CTC的单细胞核酸扩增产物做出来，中间几乎不需要任何人工操作。除了流程的简化，更重要的，Polaris还可以实现单细胞的给药处理，研究者可以用药物短时间处理所捕获到的CTC细胞，以便观察药物对于CTC细胞基因表达的影响。

  对CTC细胞进行单细胞基因表达分析可以让我们很好的了解CTC细胞间以及病例之间存在的差异。Jeffrey和Mehmet Toner两个研究小组分别对乳腺癌和前列腺癌病人的CTC细胞进行了Real-time基因表达分析。虽然经过预扩增，单细胞核酸样品依然较少，普通的Real-time体系样本需求量太大，所以需要选用更小的反应体系。两个小组均选择了BioMark HD系统，该系统是基于微流体芯片的Real-time平台，提供纳升的反应体系，并且具有极高的通量（一次最高可以检测96个细胞中96个基因的表达）。Jeffrey研究组总共检测了105个CTC细胞上87个基因的表达。根据这些基因的表达，他们对CTC细胞进行了聚类分析。从生长因子以及相关受体的表达来看，相对于实体瘤中的细胞，这些细胞处于一种相对“不活跃”的状态。研究中他们还意外的发现，在这些所检测的细胞中，不论其来源于哪一型乳腺癌病人，所有的CTC细胞都属于 “三阴性型”（ER、PR、HER2均不表达）。而这一表型的乳腺癌往往具有较强的侵袭能力。这些信息对于未来改善对于癌症诊断和治疗策略方面可能会有积极的影响。

  延伸阅读：

  Ozkumur, E. et al. “Inertial focusing for tumor antigen- dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.” Science Translational Medicine 5(179) (2013): 179ra47.

  Powell, A.A. et al. “Single cell profiing of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.” PLoS ONE 7 (2012): (5):e33788.

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