王皓毅博士：提高CRISPR/Cas9效率和通量的新策略

来自中科院、Jackson实验室的研究人员证实，利用电流来传送CRISPR/Cas9系统，不仅使得CRISPR/Cas9能够高效地实现实验室小鼠遗传改造，并且可显著提高这一系统的通量。

相比传统的技术，CRISPR/Cas9已大大提高了遗传改造实验生物，构建人类疾病模型的精度、速度和简易性。通过将CRISPR/Cas9系统注入到受精卵中，可一步构建出携带单基因或多基因突变或获得其他遗传改造的小鼠。尽管这一技术是有效的，但它需要进行显微注射――只能一次对一个受精卵实施这一有着一定技术难度且耗时的操作。

在发表于6月《Genetics》杂志上的一篇研究论文中，中国科学院动物研究所的王皓毅(Haoyi Wang)研究员、Jackson实验室基因组工程技术副主任Wenning Qin博士及同事们证实，电穿孔（采用电流来提高细胞膜的通透性）是一种可替代显微注射的更快、更高通量的策略。

王皓毅在麻省理工学院Rudolf Jaenisch实验室进行博士后研究时曾参与了CRISPR技术的早期开发。王皓毅博士说：“开发出这一电穿孔实验方案可显著提高在动物模型中进行基因组改造的效率和通量。通过这一技术我们可以从用显微注射法一次处理一个受精卵，显著提高至同时处理20-50个受精卵。”

“由于效率获得了这样子的提高，我们现在可以前所未有的效率和通量来构建出携带人类疾病双等位基因的小鼠模型。”

研究人员首先采用了一种弱酸溶液来削弱受精卵膜周围的保护层――透明带（zona pellucida），随后测试了几种电压，最终找到了一种电压在不引起细胞损伤的情况下，可将CRISPR/Cas9元件传送到细胞内。

除提高了通量，研究人员的这种电穿孔技术对受精卵侵入性及损伤有可能更小，因为它们获得了与未处理受精卵相差无几的出生率，而比显微注射受精卵的出生率高出近一倍。研究人员当前正在致力于进一步地改进这一技术，优化它使之适用于各种近交系小鼠品系。

作者简介：

王皓毅

男，1979年10月出生于河北省，博士，研究员，中国科学院动物研究所基因工程技术研究组组长。

2001年于厦门大学获得生物学学士学位，2003年于美国迈阿密大学获得动物学硕士学位。2009年于美国华盛顿大学获得分子细胞生物学博士学位，研究方向为转座子基因工程技术。2009年至2014年在麻省理工学院Rudolf Jaenisch实验室进行博士后研究，研究方向为特异性定点核酸酶在全能性干细胞和小鼠中的基因工程技术开发。主要研究方向为基因工程技术和表观遗传修饰技术的开发和应用，在近年研究中取得多项成果，包括率先成功地利用TALEN系统对于人类胚胎干细胞和诱导性干细胞进行了精确高效的基因敲除和敲入操作；利用TALEN系统建立了世界上第一只Y染色体上的基因敲除和敲入小鼠；率先利用CRISPR/Cas系统建立了在胚胎干细胞中进行多基因敲除的方法，并通过受精卵注射一步获得多基因敲除的小鼠；通过受精卵注射CRISPR/Cas系统的同时提供DNA单链和双链供体，获得基因原位敲入小鼠和条件性敲除小鼠。相关研究成果发表在Cell、Nature Biotechnology、Genome Research、Cell Research等杂志上，并获得科学同行的极大关注和科学媒体的广泛报道，曾被著名科学网站GenomeWeb评选为全世界二十名最值得关注的青年科学家之一。已发表SCI收录论文16篇，影响因子10分以上11篇，总引用次数超过800次。

推荐原文摘要：

Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Mice by Zygote Electroporation of Nuclease

CRISPR/Cas is an adaptive immune system in bacteria and archaea that has recently been exploited for genome engineering. Mutant mice can be generated in one step through direct delivery of the CRISPR/Cas9 components into a mouse zygote. Although the technology is robust, delivery remains a bottleneck, as it involves manual injection of the components into the pronuclei or the cytoplasm of mouse zygotes, which is technically demanding and inherently low throughput. To overcome this limitation, we employed electroporation as a means to deliver the CRISPR/Cas9 components, including Cas9 mRNA, sgRNA, and donor oligonucleotide, into mouse zygotes and recovered live mice with targeted NHEJ and HDR mutations with high efficiency. Our results demonstrate that mice carrying CRISPR/Cas9-mediated targeted mutations can be obtained with high efficiency by zygote electroporation