无创产前检测技术的起源和应用概述

  卫生部出生缺陷防治报告（2012）显示，我国的出生缺陷率为5.6%，每年新增出生缺陷儿数约90万例，出生缺陷不仅严重影响儿童的生命健康与生活质量，而且影响着整个国家的人口素质，增加家庭及社会经济负担，出生缺陷日益成为突出的公共卫生问题和社会问题。

  以21号染色体三体综合征（唐氏综合征、T21）、18号染色体三体综合征（T18）、13号染色体三体综合征（T13）为代表的染色体疾病，为出生缺陷疾病中最为严重的一类，患儿通常能存活至足月分娩，其中T21、T18占足月妊娠的0.2% - 0.3%，一直是我国控制和预防出生缺陷的重点。
  自20世纪90年代以来，出生缺陷的防治工作一直是我国围产保健领域的热点，众多学者也在这一领域做出了大量卓有成效的工作。目前我国已基本建立了较为成熟的产前筛查产前诊断网络体系，不过作为主要模式的中孕期血清型产前筛查模式检出率在70%左右，且有5%以上的假阳性率问题，总体筛查效能尚不能满意，因此，现有的产前筛查产前诊断体系急需一种更安全、更快速、更准确、更易标准化的检测方法出现，并在实践中探讨这种新检测方法如何纳入到现有的产前筛查产前诊断体系。
  NIPT国内外研究进展
  1997年Dennis Lo（卢煜明）等通过怀有男性胎儿的孕妇外周血血浆Y染色体PCR扩增的方法证明了孕妇外周血循环中存在胎儿游离DNA（cell free fetal deoxyribonucleic acid, cffDNA），开启了基于cffDNA的无创产前检测的新思路。
  2008年Dennis Lo又在国际重要期刊上发表文章，报道其采用大规模平行测序技术（MPS）在妊娠21三体综合征胎儿的孕妇的外周血中发现了超量的21号染色体。同时，另一研究团队也与同一时期报道了相近的研究成果。
  随后，多家独立的研究中心相继发表大规模的临床研究，再次验证NIPT对于T21、T18和T13的检测能力。早期临床研究主要关注NIPT对于高危妊娠的检测效果，包括产妇年龄、家族病史，血清学筛查高危和超声筛查高危。Palomaki等人在2011年的一项研究显示，NIPT对于高危妊娠人群的T21的检测灵敏度为98.6%，特异性为99.8%。随后该小组又于2012年公布了其对T18和T13的临床研究，取得了T18检测灵敏度100%，特异性99.7%；T13灵敏度91.7%，特异性99.1%的检测结果。Bianchi等人（2012）也采用MPS对高危妊娠孕妇的血清进行检测，但算法分析稍有不同。在这项研究中，NIPT针对T21、T18和T13检测的灵敏度分别为100％、97.2％、78.6％；特异性皆为100％。来自中南大学湘雅医院的研究小组也与NIPT服务商贝瑞和康合作，公布了他们对于412份高危人群的NIPT回顾性临床试验，取得了T21、T18、T13复合检测灵敏度100%，复合检测特异性高于99.7%的检测结果。
  上述研究证实NIPT 在高风险孕妇人群中具有较好的检测结果。为了进一步验证NIPT是否适用于低龄低风险人群或者所有风险的孕妇，北京协和医院与贝瑞和康合作，也针对低龄孕妇开展了大规模的前瞻性临床研究，分析有效样本1741例，对T21、T18、T13的检测灵敏度均为100%，特异性分别为100%、99.94%和100%。T21和T13不存在假阳性，T18的假阳性为0.06%。这项研究证实NIPT拥有远高于传统血清学筛查的灵敏度和特异性，更进一步验证NIPT未来在低风险孕妇人群的应用。一项来自于英国，针对所有风险孕妇的1005例研究发现，NIPT的假阳性率为0.1%，对于明显区分染色体非整倍体的高风险和低风险具有优势。台湾长庚医院于2014年也发表一项多中心合作研究，在100例极高危孕妇群体中，除一例45X由于DNA含量不足未能识别外，其余染色体非整倍体全部检出，复合检出率出为96.4%，而对低危孕妇的101例样本未发现染色体异常，结果证实特异性为100%。国际研究也表明NIPT在中等风险人群中应该具有类似的灵敏度和特异性，这预示着随着越来越多临床数据的积累，未来NIPT可以覆盖到中等风险孕妇人群。
  除此之外，学者对NIPT的关注点也从应用人群延伸至是否可以在更早的孕周进行NIPT检测。北京协和医院的宋亦军等人再次与贝瑞和康合作，对收集到的212例8-12孕周的有效样本进行前瞻性研究，发现8-12孕周的平均胎儿DNA含量为8.54%，且从8周至12周胎儿DNA含量呈现轻微的上升。绝大多数孕妇（95%）的血浆胎儿游离DNA含量超过NIPT的检测下限4%，早期胎儿DNA含量与孕妇的体重呈现轻微的负相关（R2=0.186）。

  表1. NIPT临床试验的灵敏度和特异性

	T21		T18		T13		X单体
	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性
Palomaki et al. 2011[31]	98.6%	99.8%	/	/	/	/	/	/
Palomaki et al. 2012[33]	/	/	100%	99.7%	91.7%	99.1%	/	/
Bianchi et al. 2012[34]	100%	100%	97.2%	100%	78.6%	100%	93.8%	99.8%
Norton et al. 2012[37]	100%	99.97%	97.4%	99.93%	/	/	/	/
Zimmermann et al.2012[8]	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
Liang et al. 2012[39]	100%	100%	100%	100%	100%	99.75%	100%	99.75%
Song et al 2013[41]	100%	100%	100%	99.94%	100%	100%	50%	100%
Shaw et al 2014[43]	100%	100%	100%	100%	100%	100%	75%	100%
Bianchi et al 2014[4]	100%	99.7%	100%	99.8%	/	/	/	/

  NIPT技术拓展
  性染色体非整倍体（Sex Chromosome Aneuploidies，SCAs）作为一大类染色体疾病，在新生儿中的发病率为1/400，显著高于常见的常染色体非整倍体。自2012年以来，研究者便开始了NIPT应用于SCAs的临床研究，但早期临床结果NIPT特异性差，北京协议医院与贝瑞和康合作开展的一项对于中国1916例低风险孕妇的临床研究显示，SCAs检测灵敏度50%，特异性100%。
  除SCAs外，未来NIPT也将适用于亚染色体的异常检测，乃至单基因疾病。Peters D等人早在2011年便发表文章，阐述其利用NIPT检测孕妇外周血，发现胎儿在12p11.22 至12p12.1区段存在4.2Mb的缺失，该结果经核型分析验证。Jensen TJ等人也在2012年发表文章，公布了NIPT可在孕期检测出Di George综合征胎儿。单基因疾病的种类很多，约有7000-8000种，单一疾病的发病率很低，但总发病率不容忽视。来自中南大学湘雅医院的研究小组近期与贝瑞和康合作，在《Clinical Chemistry》上发表文章，公布了一种名为cSMART（Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology）的单分子扩增与重测序技术对于单基因疾病威尔逊病（Wilson Disease，WD）的NIPT检测结果。研究显示在预先了解夫妇双方的致病型突变或关联SNP的前提下，通过cSMART技术检测孕妇血浆中的胎儿DNA，完成了对4例具有WD生育风险的胎儿基因型检测。结果与产前诊断100%符合，初步验证了cSMART用于无创单基因病检测的可行性。
  NIPT临床应用拓展
  目前NIPT的主要临床应用人群为高风险孕妇，不过目前国际上NIPT的多项临床研究证实了其对于低风险孕妇筛查胎儿染色体非整倍体仍具有优势。2014年的一项大规模随机对照试验显示，NIPT作为普通人群一线筛查手段的价值巨大，可10倍提高针对T21的阳性预测值，降低89%的侵入性产前诊断。因而国际上不断有建议NIPT作为胎儿染色体疾病普筛，并整合到现有产前筛查与诊断模式的声音传出，不过由于目前尚缺乏更大规模的临床试验数据加以印证，因而对于NIPT的临床定位目前仍停留在高风险孕妇的补充筛查，部分地区作为高危孕妇的一线筛查运用，但对于NIPT是否可以作为普通人群的一线筛查，或是作为其他筛查方法明确为高危人群后的序贯筛查方案，目前尚无定论。
  在中国，NIPT的临床应用目前也主要针对于高风险孕妇，几项针对中国人群的大规模临床试验也验证了NIPT对于高风险孕妇与低风险孕妇的检测有效性。若将NIPT作为普通人群的一线筛查，全面准确地卫生经济学评价是重要指标之一。除此之外，健全的法律监管与制度保护，也是一项新技术迅速发展的保障。为了规范国内NIPT的发展，建立和明确监管体制，国家卫生和计划生育委员会（简称卫计委）在2015年初下达了《关于产前诊断机构开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点工作的通知》，全国31个省市地区共有108家具有产前诊断资质的医院入选。同时公布还有《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范》，首次全面规范了NIPT的适用范围、临床诊疗流程及质量控制等重要环节，让NIPT项目在临床上的应用有据可依，正确引导了NIPT的健康发展与临床转化。
  除此之外，NIPT纵向技术的发展与临床转化也是未来众多NIPT从业者应该关注的热点。从以往取得的研究成果不难看出，NIPT蕴含的能量巨大，提高测序深度，配合恰当的生物信息学算法，NIPT的检测范围可以拓展至亚染色体，乃至单基因疾病的检测。以亚染色体异常之一的DiGeorge syndrome为例，其发病原因是由于22q11.2区段缺失3Mb的片段导致，由于片段较小，常规产前诊断技术难以发现。不过作为一种严重的遗传性疾病，患儿临床表现为多种先天性畸形，如心脏缺陷、面部畸形、发育迟缓等。DiGeorge syndrome在新生儿中的发病率为1/2000-1/4000，比18三体综合征1/3500-1/7000的发病率略高，而且从已有数据来看，90%的DiGeorge syndrome为新发突变，其再发风险为50%。但是目前对于DiGeorge syndrome的产前筛查策略基本欠缺，而且由于其大多数为新发突变，针对已有家族病史的筛查策略难以取得很好的筛查效果。NIPT针对亚染色体异常的检测能力，让我们有理由相信，NIPT用于亚染色体的一线筛查将会取得很好的筛查效果。（转化医学网360zhyx.com）