由MERS引发对传染病实验室诊断的“再认识”

事件回顾

近日，韩国中东呼吸综合征（MERS）疫情日益发酵，韩国卫生部门6月17日通报MERS确诊患者162人，死亡人数增加至20人，致死率达12.3%。除东亚的韩国外，西亚的沙特阿拉伯也确诊11名患者，3人不治身亡。欧盟也出现首例MERS死亡病例，德国卫生部门16日宣布，该国一名65岁男子在中东地区旅行期间感染中东呼吸综合征病毒，而后诱发并发症，本月早些时候死亡。由此，疫情再次输入中国的风险正显著增加，国家卫计委等部门启动MERS疫情联防联控工作机制，强化多部门信息沟通和协调联动，全力做好疫情防控。

令人担忧的是，截止6月17日，韩国出现了5例病毒经过三轮人际传染的“第四代感染者”，这与先前预期相反。实际上，此前医学界也普遍认为MERS病毒传染性“有限”，也就是说，MERS具有自限性（self-limited），其潜伏期为10-14天，通过自身免疫系统的工作，经过一段时间，就可完全清除病毒，恢复机体功能。世界卫生组织（WHO）召开紧急会议针对韩国出现的“第四代感染”疫情进行重新评估，并发表声明“中东呼吸综合征病毒可以人际传播，但我们并未观察到引发该病的病毒具备可持续的人际传播能力与社区传染情况。”

随着疫情的发展，人类对MERS病毒的认识一定会逐步清晰和深刻。

关于MERS病毒

其实早在十年前，冠状病毒CoVs就已经出现，但因为很少有因患呼吸道疾病而出现危及生命的案例，因此并没有引起大家的关注。一直到2003年，在人体内发现的冠状病毒也不过只有两种（“HCoV-229E”与“HCoV-OC43”），且都是在20世纪60年代发现的，这两种病毒仅会导致轻微的呼吸道疾病，并不算肆虐的一类病毒。2003年，随着SARS冠状病毒的出现，越来越多的变异病毒出现在人们的视野中，也引起来了全球范围内的紧急广泛关注。SARS冠状病毒爆发后，在极短的时间内，便已传播到全球30多个国家，夺取了近10%感染者的生命。仅在中国当时就有至少有5000例感染病例，其中近400人死亡，死亡率近8%。

十年后的2012年，沙特阿拉伯首次报告了2例临床表现类似于SARS的新型冠状病毒感染病例，而后在中东地区的阿联酋、约旦、科威特等国家陆续发现相同病例。2013年5月23日，世界卫生组织将这种新型冠状病毒感染的疾病命名为“中东呼吸综合征”（Middle East Respiratory Syndrome，MERS）。MERS的全称是中东呼吸症候群冠状病毒感染症，准确来说应该叫MERS-CoV。出于通俗易懂的考虑，媒体经常把MERS称为新SARS，但事实上，虽然这两种病毒同属于冠状病毒，但它们在基因上具有明确的差异，且使用不同的受体。

  随后短短两年的时间，MERS已经从发源地中东传播到了欧洲、非洲、亚洲、美洲等21个国家，但绝大多数中国人，对于MERS还很陌生。从5月20日到今天，短短一个月不到的时间，韩国MERS疫情快速爆发扩散。而我国仅有一名韩国MERS患者经香港进入广东惠州，截止目前为止，中国大陆的76名、香港的34名疑似病例已全部解除隔离，成功防止并控制了疫情的扩散。这表明我国在经历了2003年SARS、2009年甲流等多次突发传染病疫情后，传染病实验室诊断技术和疫情防控能力都有了长足的发展。同时，这十多年间荧光PCR和基因测序等分子诊断技术也获得了高速发展，它们作为突发传染病的实验室诊断技术正逐步被民众所熟悉和认可。

MERS的真身是如何被确定的呢？

6月3日，中国疾病预防控制中心病毒所和广东省及惠州市疾病预防控制中心密切合作，采用高通量测序的方法，完成了我国首例输入性MERS病例的病毒全基因组30.1Kbp的序列测定，并于当天上传至GenBank数据库。 序列分析结果表明，该病毒与当前中东地区MERS-CoV流行株高度同源，根据遗传学相关分析，初步推测该毒株最终可能来源于中东地区的沙特阿拉伯。但目前尚未发现与病毒传染性增强相关的明显证据，对于病毒基因组上少量的基因变异和重组的生物学意义正在进一步分析当中。

什么是高通量测序？它又是如何测定出病原体的呢？

传统的微生物鉴定依靠的是临床症状和经验知识。但是一些非典型病例，往往无法通过此方法检测。随着国际旅行的增加，一些热带疾病也会出现在意想不到的地区。加之人类对许多未知的微生物了解甚少，且该类微生物较难在实验室中进行培养，因此无法通过传统的培养法对其进行鉴定。高通量测序直接研究微生物的基因组信息，可以检测并鉴定全新的、无法培养的微生物，同时获得如致病性和抗生素耐药性等流行病学和生物学的信息。

以高通量测序仪器和试剂为核心的基因测序平台是一套无比强大的工具，它基于高通量测序的方法可在单个反应中检测和鉴定病原微生物的核酸信息，而无需预先知道任何的临床表现。所有的微生物采用统一的实验流程进行检测，可以客观的反应标本的真实情况，实现验证和质控。高通量测序的分析流程与传统病原微生物的鉴定和分型方法相比，具有更加全面、准确和高通量的优点。它能够以单一、高效的流程取代现有的临床微生物学实验中所需要的许多复杂技术。

高通量测序在病原微生物的鉴定中早有成功的案例，例如2013年禽流感期间，江苏省疾病预防控制中心利用高通量测序技术对患者及活禽交易市场取样的标本进行分析，发现了H7N9与H1N1的禽流感病毒联合感染，相关信息发表在《柳叶刀》及《新英格兰》杂志；此外，泰国军事医学科学研究院采用了高通量测序技术开发出了全新的无需进行培养就能鉴定流感病毒的方法。通过检测、对比细菌或病毒的基因序列，可以追寻疫情发展的踪迹，破解细菌或病毒的性质、来源、传播力和毒力，查找病毒有无变异，从而找到有效的防控和治疗措施。

然而，高通量测序因其检测周期相对较长，费用高且专业化程度要求高，因此在传染病筛查及诊断中普及率较低。在应对突发传染病时，基因测序非常适合于早期快速进行病原微生物鉴定及其变异情况的跟踪；但是在突发传染病的高危人群筛查、疑似病例诊断等疫情防控环节中，荧光PCR技术则更为适合。

什么是荧光PCR技术?

        PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种用于体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术，美国Mullis于1985年发明该技术并在1993年获得诺贝尔化学奖。自PCR技术诞生三十年来，经历了从定性PCR、终点定量PCR、荧光定量PCR、数字PCR等的发展。荧光PCR技术是指在利用PCR方法进行目标基因片段扩增时，通过实时监测其对应的荧光阈值（如CT值）特征或PCR产物的熔解曲线（如Tm值）特征从而达到定量、定性检测目标基因的目的。这不同于名噪一时的酶免技术，酶免技术的核心是抗原抗体反应，并且多以检测机体对特定物质产生的抗体为主，机体出现抗体往往需要一定的时间，而且还要机体免疫力在正常范围时才可产生。这里的“一定的时间”其实也就是我们日常所说的酶免方法检测的窗口期。PCR检测技术是否也存在窗口期呢？答案是肯定的。这个“窗口期”主要是细菌或病毒扩散繁殖的过程，相对于酶免方法检测抗体产生前的窗口期来说，PCR的窗口期就短的几乎可以忽略不计了。

荧光PCR技术检测窗口期短，可早期发现病原体，从而实现早隔离，早治疗，可较快控制疫情的发展，降低感染的机率，在传染性疾病的诊断中广泛应用，同时也在肿瘤、遗传病、慢性病、个性化诊断及精准医疗和多种生物学医学研究中得到了逐步推广。在艾滋/乙型肝炎/丙型肝炎等重大传染病的诊断治疗中，在以CT/NG/UU为代表的STD疾病的诊断治疗中，以及我国现在逐步普及的HBV/HCV/HIV三联血液安全检测领域中， 荧光PCR技术都做出了不可磨灭的贡献，且在某些方面几乎是难以替代的。

荧光PCR技术的发展得益于PCR仪器和试剂的日益成熟，许多标准中都推荐采用荧光 PCR技术。而荧光PCR仪器属于高端的科学仪器和医疗器械产品，技术要求很高，研发生产难度很大，全球也只有少数几家高科技公司拥有该类产品的生产技术和临床应用资质。我国也有少数可以生产高性能实时荧光定量PCR仪的企业。

随着核酸数据库资源的不断完善，短期内能收集到的特定物种的保守序列数量大大增多，加之世界各地不同人员收集到的数据差异很小，荧光PCR技术逐步实现标准化，这些为接下来设计的PCR引物特异性提供了高效有力支撑，同时也保证了世界范围内PCR试剂扩增的一致性，从而形成了世界范围内的大标准。2000年后我国逐步颁布了多个推荐使用荧光PCR技术的国家标准，如传染病、遗传病、肿瘤检测等。荧光PCR技术因其快速、高通量、高灵敏度、高特异性、费用低廉等特点，将长期被人们关注和使用。

正因为荧光PCR技术的上述优势，从SARS、H1N1、H7N9再到埃博拉及MERS等的诊疗方案，均推荐病毒分离、病毒PCR核酸检测同为病原学检查的实验室确诊方法，虽然病毒分离被认为是实验室检测的“金标准”，但因病毒分离培养困难，实践中主要使用荧光RT-PCR（RT-PCR，即逆转录PCR，上述传染病病毒基因大都是RNA，需逆转录为DNA后再进行PCR扩增检测）的方法进行检测。

基因测序与荧光PCR技术在突发传染病疫情爆发时的作用

疫情出现时，首先应用基因测序技术进行病原体鉴定并获得病原体的基因序列，结合形态学分析判定是否为未知微生物或已知微生物的突变体后，我们便可针对这些病原体基因的保守区核酸序列，设计引物探针和PCR核酸诊断试剂，应用PCR和分子杂交技术直接扩增和分析其DNA/RNA的特异性片段。对于已知病原体最快可以在1-2周内研发出荧光PCR法的诊断试剂。在刚刚过去不久的西非埃博拉疫情防控中，中国CFDA应急审批了几家有实力的企业研发生产的埃博拉PCR检测试剂，并将其列入我国及西非诊断埃博拉病毒和疫情防控的应急储备产品。针对此次MERS疫情，同样有企业迅速反应，其率先研发成功的MERS检测试剂目前已发往多家省级CDC及医院，用于国家流感监测网络中心、定点医院对流感样、发热病人等的初筛。

在疫情暴发时，对成千上万疑似病例重复检测的任务就交给了荧光PCR技术。应用PCR扩增设备以及特异性PCR试剂盒所建立的PCR检测体系可以对目标病原体进行基因片段的靶向检测。另外，如有需要，根据PCR检测结果，可以对可疑标本针对性地再进行基因分型检测，监控基因变异。此时，可对产生突变的病原体基因再次进行测序鉴定，不断丰富病原体基因数据库，便于疫情再次暴发时，能够快速确定病原体型别，高效指导防控工作。另外，结合流行病学调查结果，检测感染病毒的基因型在不同国家或地区的分布特点，有助于分析流行毒株的变化特征。同时也可以对疫情暴发原因进行溯源，为疫情防控提供实验室证据，对诊断疫情、研制疫苗、预防感染、临床治疗均具有重要价值。（转化医学网360zhyx.com）