多项新技术助力唾液生物标记研究

健康成人三个主要腺体每天大约要分泌1至1.5升的唾液，这些唾液中大部分是水，其它成分还包括电解质和蛋白质，例如形成粘液，分解食物和细菌的酶，以及分泌抗体所需的糖蛋白等。

虽然唾液相对于血液来说，更加容易收集，存储和运输，也更便宜，但是相关的流体研究和新型唾液，口腔诊断技术却并不方便和简单。因此设计相关的实验需要考虑已商业化可用的工具，合适的流程，稳定性，以及出现问题的策略。这些因素都会影响你的结果，尤其是如果你希望能定量分析的话。近期The Scientist杂志就总结了几位唾液研究专家，分享他们的秘诀。

分析对象是什么

DNA

唾液研究最活跃的领域之一就是从中寻找上皮细胞和白细胞的DNA进行分析，目前不少科学家们正在唾液中寻找与囊肿性纤维化（囊性纤维化）、自闭症和其他疾病相关的基因。像是Oasis Diagnostics公司就已经验证了其设备DNA•SAL 能用于多种遗传疾病和患病风险的检测，其中包括戈谢氏病、地中海贫血症和心血管疾病等。

其它也有不少公司除了提供样品收集工具，也提供保存唾液样品的提取试剂盒，此前发表在Journal of Visualized Experiments上的一个操作手册就详细介绍了从唾液中提取DNA，用于新一代测序技术分析的全过程。（原文标题：Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing）

此外，尽管唾液成分各有不同，但是大约30%唾液口水中的DNA来自于口腔中的细菌。NEB公司有一种细菌DNA富集提取试剂盒：NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit，采用一种新方法将微生物DNA与宿主DNA分离，降低测序成本。

RNA

利用RNA能检测到除了口腔疾病之外的疾病，来自加州大学洛杉矶分校的David Wong等人发现唾液中的某些RNAs与口腔以及其它癌症发生有关，文章标题为：Salivary microRNAs and oral cancer detection，采用的方法是绘制唾液miRNAs图谱，同时这篇文章也介绍了一种样品收集工具（可收集核酸和蛋白），即RNAPro•SAL。此外还有其他一些研究人员研发了从唾液细胞中分离RNA的方法（High-Yield RNA-Extraction Method for Saliva）。

唾液中大部分RNA也是来自于口腔中的细菌，Wong研究组的一项成果指出增加一步低速离心，能提高测序的深度，减少细菌RNA的干扰（The Human Salivary RNA Transcriptome Revealed by Massively Parallel Sequencing）。多肽和蛋白质

约30%在血液中发现的蛋白也会出现在唾液中，具体包括细胞因子、激素、生长因子和抗体等。研究人员也正在评估唾液蛋白作为潜在炎症、阿尔茨海默氏症和糖尿病的可能性。从技术上值得注意的是，蛋白也与RNA一样，容易受到酶的攻击，因此需要不同的收集方法。

如何收集

总体来说唾液收集没有统一的方法，这要考虑到参与实验人员的年龄，以及即将进行何种实验。而这种收集方式，以及样品在口腔中位置和收集时间会造成影响。

不同唾液分析物收集的一个金标准就是Passive drool，即实验参与者让口腔中的唾液自然汇集，然后身体前倾，让其流入一个试管中，但是这对于一些患者来说并不容易。

当研究人员的研究对象是早产儿和新生儿的时候，那么就需要婴儿的一个最常见的动作：吸吮，不过现在临床研究人员研发了一种Pedia•SAL新工具，这种设备能与安抚奶嘴连接在一起，帮助收集婴儿唾液。

还有一些工具也能通过吸取唾液进行收集，关键在于找到一个适合你目标分子的工具，“我们都知道如果用泡沫或棉花吸收唾液样本，有可能会以我们不知道的方式改变样品的完整性。因此根据你的目标分子来决定样品是否能用，”亚利桑那州大学跨学科唾液生物科学研究所所长Douglas Granger说，他同时也是Salimetrics 的创始人。

如何提高收集量

通过passive drool方法能获得足够量的样品，但是如果你需要刺激唾液分泌，那怎么办呢？

今年的一项肉食性摄入研究表明，微博熏肉的香味能促进唾液流量，同时也不会干扰激素浓度。（New Techniques for Augmenting Saliva Collection: Bacon Rules and Lozenge Drools）

除此之外，还有止咳糖、漱口水和口香糖都可以刺激唾液流量。当然首先需要确定这些刺激方法不会干扰目标物的检测，比如漱口水有可能会冲淡你的样品，Malamud说。

他也警告说，“非刺激唾液是通过吐到杯子中，还是通过像我们这样的刺激工具进行收集，也会影响结果，”改变唾液量有可能会改变某些分析物的浓度。除了刺激唾液量，还有许多因素会影响唾液的分泌速度，如年龄、运动、吸烟习惯、饮酒、时间和整体口腔健康等，个人唾液分泌速度也是定量研究必不可少的数据，一些研究人员会直接检测个人分泌速度：收集唾液量除以所花的时间。

另外一种方法就是采用新设备，来自加州大学洛杉矶分校的Vivek Shetty与他的同事就开发了这样的一种装置，目前可以通过日本Nanbu Irika公司购买这种设备，每个约为10美元（当地价格），30个280美元。

如何保存样品

唾液中含有多种可以快速降解你目标物的酶，一些目标分子，如皮质醇或褪黑激素在室温下要比其它成分更为稳定，但是一般情况下，最好还是在样品收集后立刻放到冰箱中冷藏，同时在冷冻起来之前也需要进行纯化。Slowey说。

纯化方式一部分取决于你的目标分子是在细胞内还是细胞外，这两个存在方式目前也都有试剂盒可用，如细胞外RNAs，研究人员可以离心细胞，分析或者冷冻上清液；如果是研究人类DNA，那么就可以采用细胞裂解，亲和绑定基因组DNA，洗脱其它成分。

一些稳定Buffers（Norgen，Qiagen等品牌都有）能用于中和降解DNA和RNA的酶，如果样品收集后无法麻烦放回冰箱，那么就可以利用这些试剂盒进行保存，如Qiagen 的RNAprotect Saliva Reagent，还有DNA Genotek的人类DNA，RNA收集试剂盒等。

而对细菌DNA和RNA感兴趣的研究人员来说，DNA Genotek的OMNIgene 试剂盒也是理想的长期保存方式，来自澳大利亚格里菲斯大学的David Speicher说。

蛋白是最不稳定的分析物，许多DNA和RNA的稳定试剂都不能保护蛋白，为了解决这个问题，Wong研究组在2012年的一篇文章中提出了一种稳定技术，就是预添加到RNAPro•SAL收集管中 (Method development for proteome stabilization in human saliva)。

冷冻保存时间?80℃冰箱可以长期保存唾液，但是这也是有期限的，Speicher研究组最近的研究提出了警告：无添加稳定溶液的唾液DNA，即使是保存在?80℃冰箱，14个月后就已经部分或完全降解了（Detecting DNA viruses in oral fluids: evaluation of collection and storage methods）。

因此一般来说最好样品分装，减少冷冻-解冻周期。

最后科学家们建议，如果你看了许多综述，深入了解了唾液的收集和处理之后依然不成功，那么可以打电话请教，“大多数科学家们都是乐于分享的，”Malamud说。

（转化医学网360zhyx.com）