Genome Biology：RNA-seq需要多长的读长？

  随着新一代测序（NGS）的读长在不断增长，研究人员也开始纠结：到底多长的读长才合适？双端测序是不是优于单端测序？近日，康奈尔大学维尔医学院的研究人员在《Genome Biology》杂志上发表文章，认为对于差异表达分析而言，读长并非越长越好。不过，双端测序和长的读长无疑能改善剪接的检测。
  最初，新一代测序技术只产生25或36 bp的读取，而且只能开展单端测序。如今，NGS的读长在不断增加，序列质量也在不断改善。对于许多实验而言，目前的标准读长是双端100 bp，有时甚至达到双端300 bp。
  选择测序读长，以及单端或双端测序，成为研究人员面临的主要问题之一。人们普遍认为，长的读取能带来更多的信息，而双端读取也产生了比单端读取更好的结果。不过，随着读长的增加，试剂成本和运行时间也在增加。
  为此，美国的研究人员决定看看长的读取是否对RNA-seq差异表达分析更有益。他们利用SEQC测序研究的数据来调查读长对RNA-seq结果的影响，并利用ENCODE联盟的数据来验证这些结果。
  研究人员使用了101 bp的双端读取，并修剪它们，以模拟不同的读长，并分离出读取对，以产生单端读取。对于每种读长和配对状态，他们评估了两个标准样品之间的差异表达水平，并将这些结果与qPCR的结果相比较。
  在差异表达分析中，他们使用了100、75、50和25 bp的双端和单端读取。他们发现，25 bp太短了，无法有效用在大多数的RNA-seq应用中。除了25 bp，其他所有的读长都表现出相似的准确性，而准确性也几乎不随着读长的增加而增加。一旦单端读取的长度达到50 bp，则之后的结果基本上不变。不过，与100 bp的双端读取相比，使用50 bp的单端读取能够节省一半的钱，相对可观。
  此外，研究人员也发现，剪接点的检测结果与差异表达分析不同。剪接检测依赖于序列组装，因此较长的读取会带来更好的剪接结果。与较短的读长相比，100 bp双端读取能检测更多的剪接点。他们对两个ENCODE样品进行了相同分析，发现了一致的结果，证明这些结论有着广泛的适用性。
  研究人员认为，在RNA-seq研究中使用什么样的读长，这要取决于研究的最终目的。如果只需要差异表达基因的列表，那么50 bp的单端读取就够了，还能节省大量的资源。不过，剪接的检测无疑需要双端读取和长的读长。
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