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腾讯登录研究人员研发了具有潜在癌症靶标作用的DNA二级结构的测序方法
| 导读 | DNA二级结构，比如已知的G岛区域，已经研究了很多年，包括其在基因功能，基因调控，基因组稳定，癌症进展以及药物靶标等方面的作用。然而，对于DNA的二级结构，基于计算预测等方法，来检测其形式已经被证明具有十分大的挑战性。 |
现在，来自剑桥大学的研究人员开发出了一种，基于下一代测序技术的方法，可以检测人类基因组中的G岛区域（G4）的结构。他们已经将相关结果近日发表在了《Nature Biotechnology》上。
Shankar Balasubramanian领导的实验室开发了这种叫做G4-seq的方法，其主要涉及两套Illumina公司的标准测序方法，这些方法能够使研究人员通过“扰动”来聚合酶上的检测G4结构。
该团队使用该方法描绘了人类基因组中G4位置的结构，他们计划将这个结构公布在该领域的一个公共数据库中。Balasubramanian还说，他计划将该方法用于其他的基因组中，一研究G4结构在人类疾病中的作用，并帮助靶向该区域的小分子药物推向临床实验。
Balasubramanian 说道：“这项研究提供了一个新的关于G岛区域的视野，这些结构的一部分之前是不能够用任何一种工具进行预测的。”该研究还是第一个详细的呈现基因组中G4s的实验。
G4s只能够在一定的条件下形成。G4-seq测序背后的想法，是研究人员首先先设计DNA的结构，然后根据正常的方法进行对DNA进行测序。因此，这个结构本身将会造成一个在聚合酶的检测扰动。
在这项研究中，研究人员发现G4s在钾中十分稳定，但是在钠或者锂中则不然。
为了检测在不同的缓冲液条件下，含有或者不含有G4结构的DNA的测序结果，他们根据4个已知的对照序列构建了DNA文库：这四个序列两个包含稳定的G4结构，一个突变会阻止G4形成，另一则不能标准化的折叠G4。
接下来，他们检测了含有锂，钠，钾盐的Illumina缓冲液中的文库。
三种不同缓冲液条件下整体的测序质量分数并没有受到影响。然而，当使用钾盐作为缓冲液的时候，在特定位置出现了质量分数的下降。对于含有G4s的对照区域，匹配率分别是34%和46%。
相比之下，没有G4结构的序列在所有条件中都保持较高的水平。
为了确定G4结构的存在，同时也要保证基本的精度要求，研究人员每个模板检测了两次-一旦使用钠缓冲液，G4结构就会消失，而一当使用钾缓冲液，G4结构便又形成。
通常，“如果在读数的时候Q值下降，通常是由于计算而发生的，但是你需要摆脱这些读数，并将其作为不好的序列，” Balasubramanian说道。“在我们的方法中，我们并不是这样看的。我们寻找检查这些不连续的地方，并与钠缓冲液中的数据进行比较。”他说。然后，“我们描述出这些差异，这就是我们找出这些结构的开始。”
除了钾，该团队还测试了pyridostatin（PDS），即一种稳定的G4配体。对于已知具有G4s的两个对比序列，其匹配率分别是45%和66%。此外，研究人员还注意到，在G4开始位点之后，测序错误开始积累。
“当DNA聚合酶在DNA模板上遇到一个稳定的G4，其会诱导一个暂定，这可以有效的缩短模板序列的时间，”作者写道。“当这一切发生的时候，序列将会继续产生，这将会使序列越过这个位点。”
之后，该研究小组分析了3200万个读数，其大约含有11万个可预测的G4s。在钾和PDS缓冲液中，对于G4s的预测的错赔率较高-钾中平均是20%，而PDS是35%。然而，也有一小部分序列并没有预测到G4结构，这是也显示出了相似的匹配率。“这表明，人类基因组中G4s的性质和数量可能比以前预测的更多，”作者写道。
最后，研究人员利用G4-seq全基因组测序了相关的细胞系-NA18507。他们现在钠缓冲液中进行了第一遍测序读数，然后再钾缓冲液或者PDS中进行了第二遍读数。每个实验重复生成了至少2.85亿个读数。
为了确定在开始位点潜在的G4结构，研究人员设定了一个阈值，在PDS中时25%，而钾中时14%。在这些条件下，该团队在PDS条件下获得了716310个G4s，而在钾条件下获得了525890个G4s。其中的361424个G4s已经在之前通过计算预测到了，这大约占使用PDS缓冲液检测到的73%，钾缓冲液的60%。在钾缓冲液中检测到的90%的G4s都在PDS条件下发现了，并且获得的G4s中，有383984个是在两种条件下都能检测到的。
“在明显稳定的G4条件下能够为这种方法提供一种独立的验证，”作者写道。
研究者还注意到，关于G4s的基因组位置具有几个趋势。在启动子区域，5’和3’非翻译区和重复元素的区域具有较高的密度。此外，“对于某些基因，我们发现，在基因内的一部分区域，其具有不同的密度。”这些结构与癌基因，肿瘤抑制因子，一些与癌症发展相关的拷贝数具有密切的关系。
例如，他们观察到，在MYC，TERT，AKT1，FGFR3，和BCL2L1中，G4s具有高密度，而这些基因都是与细胞复制相关的。“这也与G4s和这些基因组位点的不稳定性相一致，这种不稳定往往是癌症的标志，”作者写道。
“这些观察结果与之前的预测相一致，并且一些实验还支持了关于G4s功能的观点，”Balasubramanian说道。
除了识别预测的G4s，该团队还在一些癌症相关的基因中发现了G4s，而在此之前人们普遍认为这里并不存在这样的结构，这些基因包括BRCA1，BRCA2，BRCA3和MAP3K8，这表明这些基因可能对于使用G4s配体的疗法可能会特别敏感。
进一步的研究奖继续描绘G4s，并且研究他们可能对于癌症治疗的相关影响，“现在已经有几个靶向G岛区域的分子药物进入到了临床二期的实验中，”他说。“但是我认为，相比较于5年前，我们的数据将会将我们带到一个新的领域。”
Shankar Balasubramanian领导的实验室开发了这种叫做G4-seq的方法，其主要涉及两套Illumina公司的标准测序方法，这些方法能够使研究人员通过“扰动”来聚合酶上的检测G4结构。
该团队使用该方法描绘了人类基因组中G4位置的结构，他们计划将这个结构公布在该领域的一个公共数据库中。Balasubramanian还说，他计划将该方法用于其他的基因组中，一研究G4结构在人类疾病中的作用，并帮助靶向该区域的小分子药物推向临床实验。
Balasubramanian 说道：“这项研究提供了一个新的关于G岛区域的视野，这些结构的一部分之前是不能够用任何一种工具进行预测的。”该研究还是第一个详细的呈现基因组中G4s的实验。
G4s只能够在一定的条件下形成。G4-seq测序背后的想法，是研究人员首先先设计DNA的结构，然后根据正常的方法进行对DNA进行测序。因此，这个结构本身将会造成一个在聚合酶的检测扰动。
在这项研究中，研究人员发现G4s在钾中十分稳定，但是在钠或者锂中则不然。
为了检测在不同的缓冲液条件下，含有或者不含有G4结构的DNA的测序结果，他们根据4个已知的对照序列构建了DNA文库：这四个序列两个包含稳定的G4结构，一个突变会阻止G4形成，另一则不能标准化的折叠G4。
接下来，他们检测了含有锂，钠，钾盐的Illumina缓冲液中的文库。
三种不同缓冲液条件下整体的测序质量分数并没有受到影响。然而，当使用钾盐作为缓冲液的时候，在特定位置出现了质量分数的下降。对于含有G4s的对照区域，匹配率分别是34%和46%。
相比之下，没有G4结构的序列在所有条件中都保持较高的水平。
为了确定G4结构的存在，同时也要保证基本的精度要求，研究人员每个模板检测了两次-一旦使用钠缓冲液，G4结构就会消失，而一当使用钾缓冲液，G4结构便又形成。
通常，“如果在读数的时候Q值下降，通常是由于计算而发生的，但是你需要摆脱这些读数，并将其作为不好的序列，” Balasubramanian说道。“在我们的方法中，我们并不是这样看的。我们寻找检查这些不连续的地方，并与钠缓冲液中的数据进行比较。”他说。然后，“我们描述出这些差异，这就是我们找出这些结构的开始。”
除了钾，该团队还测试了pyridostatin（PDS），即一种稳定的G4配体。对于已知具有G4s的两个对比序列，其匹配率分别是45%和66%。此外，研究人员还注意到，在G4开始位点之后，测序错误开始积累。
“当DNA聚合酶在DNA模板上遇到一个稳定的G4，其会诱导一个暂定，这可以有效的缩短模板序列的时间，”作者写道。“当这一切发生的时候，序列将会继续产生，这将会使序列越过这个位点。”
之后，该研究小组分析了3200万个读数，其大约含有11万个可预测的G4s。在钾和PDS缓冲液中，对于G4s的预测的错赔率较高-钾中平均是20%，而PDS是35%。然而，也有一小部分序列并没有预测到G4结构，这是也显示出了相似的匹配率。“这表明，人类基因组中G4s的性质和数量可能比以前预测的更多，”作者写道。
最后，研究人员利用G4-seq全基因组测序了相关的细胞系-NA18507。他们现在钠缓冲液中进行了第一遍测序读数，然后再钾缓冲液或者PDS中进行了第二遍读数。每个实验重复生成了至少2.85亿个读数。
为了确定在开始位点潜在的G4结构，研究人员设定了一个阈值，在PDS中时25%，而钾中时14%。在这些条件下，该团队在PDS条件下获得了716310个G4s，而在钾条件下获得了525890个G4s。其中的361424个G4s已经在之前通过计算预测到了，这大约占使用PDS缓冲液检测到的73%，钾缓冲液的60%。在钾缓冲液中检测到的90%的G4s都在PDS条件下发现了，并且获得的G4s中，有383984个是在两种条件下都能检测到的。
“在明显稳定的G4条件下能够为这种方法提供一种独立的验证，”作者写道。
研究者还注意到，关于G4s的基因组位置具有几个趋势。在启动子区域，5’和3’非翻译区和重复元素的区域具有较高的密度。此外，“对于某些基因，我们发现，在基因内的一部分区域，其具有不同的密度。”这些结构与癌基因，肿瘤抑制因子，一些与癌症发展相关的拷贝数具有密切的关系。
例如，他们观察到，在MYC，TERT，AKT1，FGFR3，和BCL2L1中，G4s具有高密度，而这些基因都是与细胞复制相关的。“这也与G4s和这些基因组位点的不稳定性相一致，这种不稳定往往是癌症的标志，”作者写道。
“这些观察结果与之前的预测相一致，并且一些实验还支持了关于G4s功能的观点，”Balasubramanian说道。
除了识别预测的G4s，该团队还在一些癌症相关的基因中发现了G4s，而在此之前人们普遍认为这里并不存在这样的结构，这些基因包括BRCA1，BRCA2，BRCA3和MAP3K8，这表明这些基因可能对于使用G4s配体的疗法可能会特别敏感。
进一步的研究奖继续描绘G4s，并且研究他们可能对于癌症治疗的相关影响，“现在已经有几个靶向G岛区域的分子药物进入到了临床二期的实验中，”他说。“但是我认为，相比较于5年前，我们的数据将会将我们带到一个新的领域。”
现在的目标是揭示“这些结构对基因组作用的直接证据，并且找出相关的通路，这样我们才能真正的了解我们是否以及如何将其作为一种潜在的疗法。”（转化医学网360zhyx.com）
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