重大突破：科学家利用CRISPR/Cas9技术来成功编辑人类T细胞

  近日，来自加州大学旧金山分校（UC San Francisco）的研究人员通过研究设计了一种新型策略，其可以利用名为CRISPR/Cas9的基因编辑系统来精确修饰人类机体的T细胞，相关研究发表于国际杂志PNAS上。由于机体免疫细胞在一系列疾病的发病过程中扮演着中重要的角色，因此提供一种多样化的新型工具来研究T细胞的功能对于开发基于CRISPR/Cas9的新型疗法来治疗多种疾病提供了一定的帮助和思路。
  利用这种新型方法科学家就可以使得T细胞表面名为CXCR4的蛋白失活，当HIV感染T细胞引发艾滋病时HIV可以利用该蛋白达到其感染机体的目的；同时研究者也成功地关闭了PD-1蛋白的功能，该蛋白在癌症免疫疗法研究领域扮演着重要作用，目前研究者可以利用药物来阻断PD-1哄骗T细胞去攻击肿瘤。CRISPR/Cas9系统可以轻松对任何有机体的遗传信息进行编辑，而T细胞作为血液中循环的免疫细胞，其可以作为未来医药技术开发的靶点细胞。
  研究者Alexander Marson教授说道，实际上利用CRISPR/Cas9对T细胞基因组进行编辑非常困难，对人类T细胞基因组进行编辑是一项非常大的挑战，因此我们花费了一年半的时间来优化对T细胞的编辑技术；在这项研究中，研究者通过将Cas9及单引导RNA流线型地运输到细胞中就解决了一直以来的技术难题；Cas是CRISPR/Cas9系统中的一种酶类，其可以切割DNA并且使得遗传序列被替换。
  在实验室研究中，研究小组对Cas9核糖核蛋白（RNPs）进行了装配，其可以将Cas9蛋白同单引导RNA进行结合，随后研究者利用电穿孔技术就可以将这些RNPs快速地运输到细胞内部；利用这种创新性技术研究人员成功地对CXCR4和PD1进行了编辑，Schumann指出，目前我们花费了很长时间来将携带质粒或慢病毒的Cas9运输细胞中，随后使其在细胞中单独表达单引导的RNA，从而就可以帮助有效成功地对细胞进行编辑。
  研究者强调，最近关于CRISPR/Cas9技术编辑人类胚胎已经引发了科学界的争议，而如今又出现了利用CRISPR/Cas9来编辑T细胞的研究，我们希望这些修饰不会遗传给下一代，同时研究者还希望，基于Cas9来治疗T细胞相关疾病的疗法在未来应该快速进入临床试验中。
  将修饰后的T细胞引入病人机体其实是一种老生常谈的研究领域，目前已经有很多公司开始致力于这块的研究，利用CRISPR编辑T细胞最后或许会进入病人机体中进行研究，当然这个过程或许会存在一定的问题，但我们仍要确保过程的安全性和有效性。（转化医学网360zhyx.com）
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Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins
PNAS doi: 10.1073/pnas.1512503112
Kathrin Schumanna,b,1, Steven Linc,1, Eric Boyera,b, Dimitre R. Simeonova,b,d, Meena Subramaniame,f, Rachel E. Gatee,f, Genevieve E. Haliburtona,b, Chun J. Yee, Jeffrey A. Bluestonea, Jennifer A. Doudnac,g,h,i,j,2, and Alexander Marsona,b,g,2
T-cell genome engineering holds great promise for cell-based therapies for cancer, HIV, primary immune deficiencies, and autoimmune diseases, but genetic manipulation of human T cells has been challenging. Improved tools are needed to efficiently “knock out” genes and “knock in” targeted genome modifications to modulate T-cell function and correct disease-associated mutations. CRISPR/Cas9 technology is facilitating genome engineering in many cell types, but in human T cells its efficiency has been limited and it has not yet proven useful for targeted nucleotide replacements. Here we report efficient genome engineering in human CD4+ T cells using Cas9:single-guide RNA ribonucleoproteins (Cas9 RNPs). Cas9 RNPs allowed ablation of CXCR4, a coreceptor for HIV entry. Cas9 RNP electroporation caused up to ∼40% of cells to lose high-level cell-surface expression of CXCR4, and edited cells could be enriched by sorting based on low CXCR4 expression. Importantly, Cas9 RNPs paired with homology-directed repair template oligonucleotides generated a high frequency of targeted genome modifications in primary T cells. Targeted nucleotide replacement was achieved in CXCR4 and PD-1 (PDCD1), a regulator of T-cell exhaustion that is a validated target for tumor immunotherapy. Deep sequencing of a target site confirmed that Cas9 RNPs generated knock-in genome modifications with up to ∼20% efficiency, which accounted for up to approximately one-third of total editing events. These results establish Cas9 RNP technology for diverse experimental and therapeutic genome engineering applications in primary human T cells.

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