天生一对：CRISPR/Cas9与AAV

CRISPR/Cas9已经成为体外基因组编辑的最流行系统，但体内的基因编辑方法仍然受到Cas9导入问题的限制。腺相关病毒载体（AAV）因免疫原性低而常常用于基因的体内导入。不过，化脓链球菌（spCas9）和嵌合sgRNA（总共~4.2 kb）要包装到AAV载体中还蛮有挑战性的，因为AAV只能容纳~4.5 kb。尽管这种方法已被证明是可行的，但留给其他调控元件的位置也不多了。之前，张锋研究组将Cas9和多个gRNA包装到AAV载体中，提高了整体的包装能力，但必须纯化和共感染两个AAV。

为了最大限度提高AAV的能力，Gang Bao的研究小组开发出一种分裂内含肽的Cas9，它可分在两个AAV表达框中，将更多空间留给调控序列和gRNA。不过，为了让Cas9和gRNA在一起，这个构建体必须更小。之前的尝试是使用来自嗜热链球菌的St1Cas9（~3.3 kb）和截短的Cas9。不过它们都有一些缺点：St1Cas9需要非常特异的PAM序列，限制了可靶定位点的数量，而截短的Cas9则效率要低得多。

张锋研究组的Fei Ann Ran等最近也开发出一种新的策略来克服这些缺陷。为了发现更短、但同样有效的Cas9酶，他们分析了600多个Cas9的直系同源物，并发现这些分为两类：一类大约有着1350个氨基酸，包括SpCas9，而另一类则有着约1000个氨基酸。在那些较短的同源物中，只有金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）在哺乳动物细胞中表现出切割活性。SaCas9产生插入/缺失，效率与SpCas9相似，这使得研究小组把精力都集中在SaCas9的研究上。

CRISPR/Cas9基因组编辑的另一个缺陷是可能发生脱靶效应。为了比较SpCas9和SaCas9的脱靶效应，研究人员使用了一种称为BLESS的方法。利用这种灵敏的方法，他们发现SaCas9并没有表现出比SpCas9更高的脱靶活性，确认它适合体内研究。

为了检验AAV-SaCas9在体内的效率，Ran等人利用肝特异的血清型AAV8创建了一个all-in-one的SaCas9和sgRNA构建体。由于CRISPR/Cas9的基因编辑效率随目标而异，他们检验了小鼠中的两个基因。对于这两个基因，他们在注射1周后都观察到插入/缺失的形成和表型的变化。小鼠肝脏在组织学上表现正常，与AAV-GFP对照相比，肝损伤标志物也没有增加。AAV-SaCas9-sgRNA不仅介导了基因组修饰，也没有引起明显的免疫应答。

今年4月，研究小组在《Nature》杂志上展示了他们的成果。张锋表示：“我们的长期目标是将CRISPR开发为一种治疗平台。这种新的Cas9为扩大我们的Cas9清单，帮助我们构建出更好的疾病模型，鉴别出一些机制，以及开发出新疗法提供了一个支架。”

（转化医学网360zhyx.com）