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腾讯登录研究人员研发LR-PCR和NGS结合的方法来检测PMS2基因突变
| 导读 | 来自贝勒医学院和贝勒Miraca遗传研究室的研究人员近日已经开发了一种更精确的方法来检测PSM2基因的突变，他们的研究结果近日发表在了《Journal of Molecular Diagnostics》上。 |
PMS2基因突变是与遗传性非息肉大肠癌（Lynch综合征）以及Turcot综合征相关的，并且其是造成神经外皮层肿瘤的一个原因。
为了改善PSM2基因突变检测的精确度，研究人员使用了多路复用探测放大器（MLPA），靶向捕捉物的下一代测序，以及远程PCR（LT-PCR）。他们用他们的方法对32个临床样本和14个对照样本进行了检测（8个阳性样本和6个阴性样本）。
根据美国国家卫生研究（NIH）的说法，美国每年有14万例结直肠癌诊断案例，但是只有3%到5%是由Lynch综合征引起的。然而，参与了本研究的研究人员认为，PMS2基因在Lynch综合征发展中的作用被低估了，因为在结直肠癌中使用PMS2免疫组化负染色的高频率可能丢失了很多PMS2突变案例。他们表示，他们相信，这种基因的精确的分子分析被基因组区域中高度同源的序列以及活跃基因和假基因之间频繁的交流所阻碍。
之前，PMS2突变是使用Sanger测序进行检测的，其主要分析外显子编码区和内含子的外翼区，这种方法并没有提供拷贝数突变的信息。研究人员的新方法结合了LR-PCR和NGS，这可以使他们能够检测序列突变和CNVs，以及从其假基因PSM2CL中区分出PMS2基因突变。他们还能够生成远程，连续均匀覆盖的特定基因微点的LR-PCR片段，这些片段会包含多个外显子和内含子，这对于如PMS2基因区域附近的高度同源区域之间的CNV区分是十分重要的。
“LR-PCR/NGS的联合使用和靶向NGS捕获物解决了等位基因和同源性两个问题，”研究人员在JMD的文章中写到。“因此，这种方法对于检测具有可能PMS2突变的早期癌症患者具有特别的优势。”
研究人员分析了每个样品运行的三个过程-MLPA，NGS和LR-PCR。MLPA是使用 MRC-Holland SALSA MLPA kit P008-C1进行的，其含有针对PMS2外显子1到11，外显子11到15，以及靶向PMS2和PMS2CL的外显子11到15的序列变异的探针。而对于捕获NGS，研究人员使用了罗氏的 NimbleGen SeqCap探针文库，其可以靶向所有外显子以及197个遗传性癌症基因的内含子侧翼区域。
对于之后的LR-PCR，他们使用了之前公开的三个引物扩增片段-E1到E5，E6到E10和E11到E15-他们都可以用于PMS2和PMS2CL假基因。LR-PCR使用Clontech实验室的TaKaRa LA Taq DNA polymerase Hot-Start Version，PMS2的LR-PCR产物片段化，然后使用Illumina的HiSeq2000平台进行高通量测序分析。
“从这三种方法得出的结果，通过交叉验证增强了准确性，并且减少了周转时间，”他们表示。
为了改善PSM2基因突变检测的精确度，研究人员使用了多路复用探测放大器（MLPA），靶向捕捉物的下一代测序，以及远程PCR（LT-PCR）。他们用他们的方法对32个临床样本和14个对照样本进行了检测（8个阳性样本和6个阴性样本）。
根据美国国家卫生研究（NIH）的说法，美国每年有14万例结直肠癌诊断案例，但是只有3%到5%是由Lynch综合征引起的。然而，参与了本研究的研究人员认为，PMS2基因在Lynch综合征发展中的作用被低估了，因为在结直肠癌中使用PMS2免疫组化负染色的高频率可能丢失了很多PMS2突变案例。他们表示，他们相信，这种基因的精确的分子分析被基因组区域中高度同源的序列以及活跃基因和假基因之间频繁的交流所阻碍。
之前，PMS2突变是使用Sanger测序进行检测的，其主要分析外显子编码区和内含子的外翼区，这种方法并没有提供拷贝数突变的信息。研究人员的新方法结合了LR-PCR和NGS，这可以使他们能够检测序列突变和CNVs，以及从其假基因PSM2CL中区分出PMS2基因突变。他们还能够生成远程，连续均匀覆盖的特定基因微点的LR-PCR片段，这些片段会包含多个外显子和内含子，这对于如PMS2基因区域附近的高度同源区域之间的CNV区分是十分重要的。
“LR-PCR/NGS的联合使用和靶向NGS捕获物解决了等位基因和同源性两个问题，”研究人员在JMD的文章中写到。“因此，这种方法对于检测具有可能PMS2突变的早期癌症患者具有特别的优势。”
研究人员分析了每个样品运行的三个过程-MLPA，NGS和LR-PCR。MLPA是使用 MRC-Holland SALSA MLPA kit P008-C1进行的，其含有针对PMS2外显子1到11，外显子11到15，以及靶向PMS2和PMS2CL的外显子11到15的序列变异的探针。而对于捕获NGS，研究人员使用了罗氏的 NimbleGen SeqCap探针文库，其可以靶向所有外显子以及197个遗传性癌症基因的内含子侧翼区域。
对于之后的LR-PCR，他们使用了之前公开的三个引物扩增片段-E1到E5，E6到E10和E11到E15-他们都可以用于PMS2和PMS2CL假基因。LR-PCR使用Clontech实验室的TaKaRa LA Taq DNA polymerase Hot-Start Version，PMS2的LR-PCR产物片段化，然后使用Illumina的HiSeq2000平台进行高通量测序分析。
“从这三种方法得出的结果，通过交叉验证增强了准确性，并且减少了周转时间，”他们表示。
PSM2基因突变的更精确的确定方法可以为具有结直肠癌风险的人群提供更好的预防，诊断和治疗选择。此外，研究人员还认为，这种方法可以用于其他含有高度同源的多拷贝序列的基因的突变分析。（转化医学网360zhyx.com）
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