为CRISPR设计高效sgRNA的新方法

  CRISPR-Cas9技术，为基因组工程提供了一个强大的系统。然而，不同单导向RNAs（sgRNAs）之间的可变活性，仍然是一个重要的限制。八月三十一日在Nature子刊《Nature Methods》发表的一项研究中，来自耶鲁大学医学院的研究人员，分析了影响体内sgRNA稳定性、活性和装载的分子特征。
  基因组编辑系统，对于利用反向遗传学来理解基因功能，是必不可少的。锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已被广泛用于产生短的插入或缺失（indel）突变。这些技术可使研究人员在多个生物系统中、通过蛋白质为基础的DNA识别，进行遗传工程，但是，它们受限于其可变的效率和繁琐的组装。最近，原核CRISPR-Cas9机制通过使用限制性内切酶Cas9和与靶DNA互补的sgRNA，可适用于真核细胞。它已成功地用于一些模式生物的诱导靶向基因突变，如线虫、果蝇诱导、小鼠和斑马鱼。然而，不同sgRNAs的可变活性，仍然会导致不一致的CRISPR-Cas9活性。确定体内sgRNA的稳定性、装载和打靶的分子特征，在很大程度上仍有待于探索。
  最近，在人类和小鼠细胞系中开展的研究，已经鉴定了一些特征，可调节CRISPR-Cas9活活性，通过表型选择进行了评估。因此，外在特征（如微环境介导的双链断裂DNA修复和有害突变的选择）的影响，是很难与sgRNA固有特征的影响分开的。事实上，与高sgRNA活性相关的一个最强的特点是，sgRNA中的尿苷消耗，这实际上与用来表达sgRNAs的Pol III转录机制的终止信号相关。Gagnon和合作者绕过了这个问题，斑马鱼胚胎中靶定了100多个基因在，每一个都有一个单sgRNA。生物通 www.ebiotrade.com他们证实，毗邻protospacer相邻基序（PAM）的一个鸟嘌呤有助于分裂，这与在细胞系中开展的研究相一致，并指出了与靶向效率相关的其他特征序列。然而，目前尚不清楚的是，所检测的特定基因组位点对这些特征有多大的影响，因为每个基因只有一个sgRNA被评价。这可能会限制识别特定特征（介导sgRNA活性，如稳定性、Cas9装载和靶标识别）的能力。因此，利用CRISPR-Cas9系统在体内进行有效打靶的根本原理，尚不清楚。
  在这项研究中，研究人员分析了1280个sgRNA（靶向128个基因）的稳定性、装载和致突变活性。他们发现，鸟嘌呤富集和腺嘌呤的消耗，可增加sgRNA的稳定性和活性，而特异的sgRNA装载、核小体定位和Cas9脱靶结合，并不是主要的决定因素。
  研究人员还确定了被一个或两个核苷酸截短的sgRNAs，它们含有5′错配，被确定为典型sgRNAs的有效替代选择。在这项结果的基础之上，研究人员构建了一种预测性的sgRNA评分算法——CRISPRscan，可有效地捕捉到影响CRISPR-Cas9体内活性的序列特征。
  最后，该研究小组发现，利用Cas9-nanos 3′ UTR将Cas靶定到生殖细胞，可产生母系合子突变体，也能提高存活率，并降低体细胞突变。总而言之，这些结构确定了影响Cas活性的决定因素，并为体内基因组打靶的高效sgRNA设计，提供了一个框架。