盘点：循环肿瘤细胞（CTCs）的监测手段

  循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是脱落进入血液循环的肿瘤细胞，通过采集一定定量的外周血监测其在血液中含量的变化，可用于证实肿瘤的存在、发病过程、评估患者的预后、识别患者接受治疗后临床状况的改善情况、耐药情况等作出诊断。
  CTCs—肿瘤转移的种子
  早在1889年，Paget提出了 “种子和土壤”的学说，强调癌细胞和微环境之间的关系，认为肿瘤转移的形成，是处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。在1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTCs的概念。不过长时间以来CTCs的检测并未在肿瘤患者的防治中发挥应有的作用,主要原因就是检测技术未取得突破性进展。从上世纪末以来CTCs检测技术得到了不断的改进，随之带来的是CTCs检测在临床的应用。FDA于2004年批准了CellSearch系统在转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌治疗中的应用，随着CTCs研究的不断深入，越来越多的肿瘤治疗会得益于CTCs的检测。
  CTCs的检测手段有哪些
  目前各种CTC富集技术基本上是基于以下三种原理：免疫捕获、细胞大小、其他特征的识别（如细胞密度、电荷、形变能力等），前两种是目前应用较多的方法。富集后对其中的CTCs进行鉴定，目前主要通过免疫荧光、H.E染色、荧光定量PCR、FISH等分子方法检测某个或某些生物标志物而实现。由于只要把CTCs富集到，就可以根据不同目的而使用不同的生物标志物来进行鉴定，因此现阶段的焦点问题还是CTCs富集的方法学问题。
  总结起来，CTC技术主要分为以下几种：
  1、以CTCs表面抗原和免疫荧光为基础的方法
  市场上已有多种应用这种原理的检测设备，如CellSearch系统、CTC-Chip、免疫磁性细胞分选仪(MACS)、RARE Cell、AdnaTest癌细胞检测系统等。以CellSearch系统为例，CellSearch系统是目前惟一被FDA批准进入临床，用于预测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的CTCs检测技术，这种技术集合了免疫磁珠分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。
  但是，各种不同组织来源的肿瘤细胞只有70％表达EpCAM，一些肿瘤细胞由于发生了上皮间质转化（EMT) ，上皮细胞特异性抗原丢失使得单一抗体捕获CTCs的效率降低。因此会发生一些极端例子，比如已经全身多处肿瘤转移的病人，由于癌表面的抗原已经脱落，反而会出现假阴性的结果。
  2、以细胞大小差异和过滤为基础的方法（ISET）

      新加坡的ClearBridge公司正是采用的这种方法， ClearCell? FX1是该公司最新研发的产品，该系统由微流体芯片（CTChip?FR）驱动。这种微流体芯片通过曲线通道中的“固有迪恩涡流”对CTC与其它血液成分的大小、形变能力和惰性进行区分从而分离出CTC，这一过程也叫迪恩流分离（DFF）。经过DFF步骤，血细胞在CTChip?FR的通道中分散分布，大细胞会沿附在内壁而小细胞则会远离内壁。ClearCell? FX 系统因此得以高效快速地分离CTC而不会损害细胞。简单点说，就是根据癌细胞的物理特性进行分离，保持了癌细胞的生物活性。
  与市场上常用的CTC富集系统相比，ClearCell? FX1具有三大优势：
  1）准确度、敏感度更高，且无需标记。该系统利用的是癌细胞的物理特性，富集效果不受癌细胞抗原脱落的影响，与市场上同类产品相比，其灵敏度要高几十倍，且无需标记。
  2）富集到的CTC纯度更高。7.5ml血液，通过ClearCell? FX系统分离，富集到的CTC中夹杂的白细胞约在500-2000之间，而通过抗体富集得到的CTC中，白细胞的含量约在1000-10000之间。
  3）保持了癌细胞的生物活性。ClearCell? FX1利用的是癌细胞的物理特性，能够保持癌细胞的生物活性，便于后续进行体外培养、动物模型建立及相关检测，研究癌症的生物学机理和开发新疗法。
  目前上海立闻医学检验所正和新加坡的ClearBridge公司开展战略合作，已经在临床进行了多例验证，效果理想，在一位肠癌患者血液中成功富集到了肿瘤细胞团（claster），并从另一位肺癌患者血液中成功富集到了CTC,移植于免疫缺陷动物体内，成功建立了动物移植瘤模型3、以DNA/RNA为基础的检测方法
  CTCs的某些基因或表达的mRNA不存在于正常的血细胞中，可通过对这些DNA或RNA的检测来判断CTCs的存在。这种RT-PCR的方法非常灵敏，可分析极微量RNA，然而因为该技术是以信号放大为基础的，稍有污染就容易造成假阳性的结果出现，目前，其在临床应用中最大的限制就是，缺乏明确的特异性标志物，发现明确的肿瘤细胞特异性mRNA对于促进CTCs检测的特异性及准确性至关重要。
  与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果。而且分离富集CTCs只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的。更为重要的是，CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。