Nature，Science揭示CRISPR“跳过”机制

作为新一代基因组编辑技术先锋，CRISPR炙手可热，这种最初被微生物学家用以了解细菌免疫力的技术方法在过去的5年里，研究人员已经转而将CRISPR/Cas9发展为生物学研究的有力工具。近期来自加州大学伯克利分校，霍德华休斯医学院等处的研究人员破解了关键酶Cas9识别全基因组中靶标的重要机制，这将有助于更有效的完善CRISPR基因编辑技术。 

这一研究成果公布在11月12日Science杂志上。

领导这一研究的是加州大学伯克利分校Jennifer Doudna教授，Doudna教授与Emmanuelle Charpentier 2012年在Science杂志上发表的一项论文中指出，细菌用以对抗病毒的CRISPR-Cas9系统可以作为简单、灵活的基因组编辑工具，由此她俩获得了生命科学突破奖（Breakthrough Prize in Life Sciences）。

在研究CRISPR序列过程中，科学家们发现许多与这些序列功能存在关联的核酸酶或螺旋酶, 统称为CRISPR-相关因子(CRISPR-associated, Cas), 这也就是CRISPR-Cas系统的由来。

其中，具有核酸内切酶活性的Cas蛋白是细菌获得抗性，催化DNA剪切的关键所在，但是至今为止我们对于这种酶如何在这么庞大的全基因组中进行搜寻，如何跳过那些“无用”的序列，找到靶标序列的机制知之甚少。

在这篇文章中，研究人员利用时差单分子成像技术（time-lapsed single molecule，生物通译）追逐了活体小鼠细胞中的Cas-9蛋白，然后用这一数据计算Cas9蛋白保持稳定的概率。

Cas9蛋白作用需要crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA：tracrRNA/crRNA二元复合体指导其在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA。Cas9核酸酶有两个功能结构域：RuvC和HNH。当两个结构域激活时，HNH核酸酶结构域剪切互补链， RuvC结构域剪切非互补链，在基因组上产生双链断裂（DSB）。

在追踪过程中，研究人员发现Cas9行动非常快，在一秒不到的时间里就能鉴别基因序列是不是靶标，而且虽然Cas9能快速分散到整个基因组大部分区域内，但是在稠密的异染色质DNA中，Cas9速度会降低，这些区域也就是紧密包装的染色质区域，经常出现在细胞核的周围。不过即使在这里Cas9受到了束缚，但是仍然能结合上去。

这些发现揭示了Cas9蛋白在基因组中进行搜寻的机制，表明Cas9的快速“跳过”机制是确保CRISPR作用的前提，这一新见解将有助于完善CRISPR基因编辑技术。

同期Nature杂志也发表了这一研究组的相关成果：Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。

在这篇文章中，研究人员提出了一个模型：Cas9核酸内切酶利用了多个层次的调控来确保精确切割靶DNA。除了通过PAM结合及在sgRNA–DNA互补基础上定向解旋DNA识别潜在靶序列，识别靶DNA序列驱动了HNH核酸酶结构域发生了构象改变。这一结构转变触发了RuvC结构域催化活性，确保了协调切割两条DNA链。部分互补的脱靶DNA序列或许可以稳定结合Cas9，但却无法驱动HNH构象改变，从而避免的切割。
（转化医学网360zhyx.com）