【干货】血液检测：关于cfDNA、ctDNA、CTC的那些事儿

  随着精准医学概念的提出，精准医学已经逐渐被人群接受，肿瘤便是精准医学首要解决任务之一。说起肿瘤、癌症，已经不再像多年前一样让谈癌色变，但仍旧为人们所恐惧。成功治疗肿瘤还是以早发现早治疗为主。那么尽早检测和发现肿瘤便是首当其冲的核心。液体活检(Liquid biopsy)的检测方法，可以捕获到进入血液的其它细胞或DNA，从而替代了疾病的诊断，例如肿瘤。最近比较火热的液体活检有：cfDNA、ctDNA和CTC的检测。
  关于cfDNA
  首先，cfDNA是什么？其实就是血液中游离的DNA片段。外周血中的cfDNA的含量能说明什么？有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。基于cfDNA的液态活检中，尽管ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作为液态活检，不只是局限于肿瘤学。例如，有研究报道对于接受器官移植手术的病人，可以通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征，片段化的cfDNA含量变化，来评估移植器官的排斥情况。在无创产前基因检测中，采集孕妇外周血(5ml)，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿是否存在基因异常情况，如患染色体非整倍体（21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体）的风险。
  关于ctDNA
  ctDNA，即循环肿瘤DNA片段。ctDNA主要是死亡的肿瘤细胞破裂后所释放出来的、片段化的基因组DNA。理论上，所有的肿瘤都会产生ctDNA。ctDNA中能够检测到的遗传变异信息非常丰富，从简单的点突变到复杂的结构变异（structural variation），甚至染色体拷贝数变异都能够检测到。但是，ctDNA的检出率是高度依赖于肿瘤发展阶段、肿瘤类型和检测手段这三个重要因素。
  至于为什么肿瘤细胞会将DNA释放到血液中呢？科学家给出了三种主要的解释：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、来自于凋亡的肿瘤细胞；3、来自于肿瘤细胞分泌的外排体。但是还有一些问题尚未明确，如循环肿瘤细胞是否也释放了部分ctDNA，这三种来源对于ctDNA的贡献比例是怎样的等等。
  肿瘤发展阶段上，ctDNA含量通常在晚期或转移性肿瘤中较高，而在早期或局限性肿瘤中含量较低。在不同类型肿瘤中，ctDNA水平也存在差异。研究人员发现，在640例患者中，ctDNA可检测超过75%的晚期胰腺癌，卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌，以及头颈癌。然而，在原发性脑、肾、前列腺癌和甲状腺癌的检测却不到50%。
  目前，ctDNA可以作为肿瘤预后的标志物，而且也能够用来预测药物治疗的效果，这也是ctDNA作为肿瘤监测应用非常重要的一个方面。
  关于CTC
  CTC，即循环肿瘤细胞 (Circulating tumor cell, CTC) ，是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
  1889年，Paget提出了“种子和土壤”的学说，强调癌细胞和微环境之间的关系，认为肿瘤转移的形成，是处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。期间，有专家提出了“解剖--机械”学说，认为CTC的转移为随机现象，CTC在最先到达脏器的毛细血管或淋巴结发生机械性滞留。在1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTC的概念。从上世纪末以来CTC检测技术得到了不断的改进，随之带来的是CTC检测在临床的应用。
  目前FDA认证的CTC应用，主要是指通过CellSearch平台的CTC计数来辅助评估转移性乳腺癌、转移性前列腺癌和转移性结直肠癌的疾病进展，主要包含以下几个方面：
  1、接受化疗的癌症患者基线的CTC数量（Cut-off值：乳腺癌/前列腺癌是5个CTC/7.5ml血，结直肠癌是3个CTC细胞/7.5ml血），可预测治疗后无进展生存时间和总生存时间，以此作为患者是否需要接受辅助化疗的参考；
  2、接受化疗的癌症患者CTC的数量变化，可预测治疗后的无进展生存时间和总生存时间，以此作为肿瘤进展、转移复发风险评估的参考；
  3、接受化疗的癌症患者CTC数量，可用于实时反映肿瘤负荷，以此作为肿瘤药物耐药性的监测。
  研究表明，在极少数肿瘤高危人群中的确能够检测出CTC，能够很准确地提示肿瘤的发生，并且远早于影像学证据。
  CTC在肿瘤早期筛查/诊断中的难点在于：
  1、CTC在肿瘤患者外周血中含量很低，在癌前病变或肿瘤早期数目更加稀少。一般患者10ml血中只有1-10个CTC，而 10ml血液里面有500亿个红细胞和上亿白细胞，以及多种的稀有细胞，比如巨核细胞、内皮细胞，未成熟的造血细胞，上皮细胞等，这些细胞在正常血液中很少见到，但在癌症患者的血液中容易被误认为CTC。这对应用于肿瘤早期筛查/诊断的CTC检测技术，提出了更高的要求。
  2、CTC应用于肿瘤早筛，较多的基于特定类型肿瘤的高危人群（例如慢性阻塞性肺病和肺癌）开展分析和相应推论。但就检测到CTC所选取的特征值（如数量，CD45抗原阴性，EpCAM阳性，特定肿瘤基因突变等），只能推断这种细胞可能是恶性肿瘤细胞，而不能进一步确诊为何种肿瘤细胞。未来的研究，应进一步完善单细胞水平上肿瘤类型的区别性诊断方案。
  总得来说，普通健康人中cfDNA含量低，超过90%的健康个体每毫升血浆中的cfDNA量不超过25ng，而患者的cfDNA水平是健康人的数倍。ctDNA的灵敏度高于CTC，但针对肿瘤早期筛查或诊断，CTC的准确性优于ctDNA。
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