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全自动Wes蛋白印迹让大分子量蛋白不再“难测”

首页 » 研究 » 检验 2016-01-05 转化医学网赞(4)

导读	不管是基础研究还是转化医学，特定样本中特定蛋白质的表达情况可为研究者提供丰富的生物学信息。

不管是基础研究还是转化医学，特定样本中特定蛋白质的表达情况可为研究者提供丰富的生物学信息。如临床样品中疾病特异性Biomarker的检测定量可作为疾病诊断、病患分型及疗效评估的重要参考依据；药物筛选活动中，也常常通过药物靶标及其下游通路蛋白的表达量或修饰状态来评估潜在的药效。著名的抗白血病药物Gleevec（格列卫）即以酪氨酸激酶为作用靶标。
特定蛋白质的检测定量常常基于免疫学手段，如Elisa、luminex、免疫组化、Western Blot等等。前三项技术直接以原始样品进行检测，靶标蛋白与样品杂蛋白无分离步骤，由于生物学样品的复杂性及抗体质量导致的非特异性结合，常常产生假阳性信号而无法识别剔除。而Western Blot技术采取先分离后检测的策略，不仅能将靶标蛋白定量，同时具备根据分子量信息进行靶标“鉴定”的优点。因此，即使由于样品复杂性及抗体质量导致非特异信号，我们仍然可以根据分子量信息将真正的靶标进行检测定量。翻翻生物学杂志，不难发现几乎每一篇文献均有Western Blot这一经典而强大的技术身影。但是，传统的基于凝胶的Western Blot也存在两方面的问题，一定程度上限制了其应用：
1. 步骤繁多、耗时过长：需经历制胶、电泳、转膜、封闭、一抗、洗涤、二抗、洗涤、发光等繁琐步骤，且需手工操作，耗时1-3天，不仅给实验者带来沉重的身心负担，结果的重复性及重现性也很难保证。

2. 大分子量蛋白检测困难：传统凝胶Western Blot检测中小分子量蛋白比较适合，而面对超过150 KD的大分子量蛋白常常倍感压力。第一，由于分子量较大，常常采用低浓度凝胶。这种凝胶柔软易裂，需要极其轻柔小心的操作，但并非所有实验室都有条件配备小师妹这种重要的战略资源。第二，转膜效率低，并且不稳定。花费大量的时间精力摸索转膜时间、缓冲液配方及电压电流，显影时却常常得到微弱、灰度不均一的条带图谱，无法进行稳定准确的定量。

低浓度胶易碎

转膜效率低、不均一、不稳定

位于美国加州的高科技公司Proteinsimple推出了令人耳目一新的Simple Western技术，基于Wes仪器平台，对传统Western进行了彻底的革新，将Western blot的实验步骤全部自动化，无需手动制胶跑胶、无需转膜、全自动完成蛋白上样、分离、免疫印迹、洗涤，以及检测和数据的定量。整个检测流程不到3小时即能全部完成，真正做到无人值守，实验员完全可以下班前放上一批样品，而第二天早上直接收获实验数据。25或13个/次的样品通量选择更加灵活。并且WB定量分析更加标准化，更加客观，实验结果更易被杂志接收。

同时，Simple Western技术包括两类试剂盒，一种检测12-230 KD范围的蛋白，另一种用于上文提到的66-440 KD范围的大分子量蛋白。专利的液体胶技术使高达440 KD的大分子蛋白检测毫不费力，操作上也无需任何额外的注意事项。如下图的ATM及ATR蛋白，其中ATM与DNA的损伤修复有关，ATR也与DNA的损伤修复有关。（2015年诺贝尔化学奖即颁发给DNA损伤修复方面的研究。）两者分子量分别高达290 KD和250 KD，传统的Western Blot几乎无法实现如此大蛋白的转膜定量。