TUBB8 基因突变致人类卵子减数分裂阻滞

  导读：2016年1月21日，复旦大学生物医学研究院王磊教授及其团队在国际顶级医学杂志《新英格兰医学杂志》上阐述了导致人类卵母细胞成熟障碍的遗传机制。王磊教授一直致力于利用分子遗传学手段寻找人类生殖疾病相关致病基因，并利用细胞、动物模型对相关基因功能展开深入的研究，在本次研究中，他利用遗传及功能基因组学手段揭开了人类卵子成熟障碍之谜。

  研究思路：

  研究人员对一个具有常染色体显性遗传模式的四代家系（家系1）进行研究（图1）。女性患者的配偶为正常健康男性。

  表1    7个家系不孕患者中含有TUBB8突变卵母细胞的特征及临床特征

  对不孕患者III-4的3个处于减数第一次分裂中期和1个表型不正常的卵细胞注射精子，在显微镜下观察发现，没有一个卵细胞可形成纺锤体（图2A和2B）。全外显子测序分析家系1中的5位成员（3个患者和2个正常），结果鉴定出1个突变位点：TUBB8基因编码区杂合性错义突变c.T686C (p.V229A)。TUBB8基因编码灵长类动物特有的β-微管蛋白亚型。这一突变在家系1中的不孕女性中共分离并且表现为父系遗传模式（图1）。除此之外，研究人员还在7个临床表型相似的不孕患者中鉴定出TUBB8另外6个突变位点，具体信息如下：家系2中2位患者（c.G1249A，p.D417N）；家系5中的1位患者（c.T1088C，p.M363T）；家系6中的1位患者（c.G5A，p.R2K）以及家系7中一位患者（c.G900A，p.M300I），再加上家系3和4中的denovo突变（c.C527T，p.S176L和c.G785A，p.R262Q）（图1）。分别对家系1、2、3、4和6中不孕患者的处于减数第一次分裂中期的卵母细胞进行免疫染色，结果显示卵母细胞中的纺锤体要么为非正常状态，要么检测不到纺锤体存在（图2C）。因此，所有的不孕患者均不能生成成熟的处于减数第二次分裂中的卵母细胞。针对不同发育阶段的卵母细胞利用特异抗体进行免疫染色，结果证实TUBB8定位于纺锤体中。

  为了检测体内TUBB8突变对微管产生的影响，研究人员将FLAG标记的重组质粒转染HeLa细胞系。转染野生型TUBB8的细胞系中，可观察到组装正常的微管网络（图3A），而转染突变型TUBB8，不论是正常还是高水平表达，组装出的微管均呈现出不正常表型，并且会导致微管网络的整体缺失。这种缺失表型与预测的可能干扰异二聚体稳定性，β-微管蛋白折叠，或者聚合作用的突变(V229A，S176L，M363T，R2K和M300I)显著相关。微管组织结构变异表型则由干扰驱动蛋白结合相关的突变（R26Q2和D417N）引起（图3B）。

  为了确立TUBB8突变和不孕表型之间的必然联系，研究人员将野生型和突变型的TUBB8 RNA显微注射小鼠卵母细胞。注射野生型TUBB8 RNA的卵母细胞，在胚泡破裂大约12h后形成正常的成熟卵母细胞，而注射任何一种突变的TUBB8 RNAs导致卵母细胞成熟受到抑制，并且形成畸形的纺锤体。同时，第一极体排除率显著降低（6-33% vs 61±2.2%）（图4A）。研究人员将显微注射的RNA浓度提高（1000ng/ul），结果显示，高浓度的突变型TUBB8 RNA（S176L和 D417N）最终导致纺锤体严重甚至彻底受损（图4B）：出现卵母细胞成熟障碍表型。为了进一步验证TUBB8这一突变效应，研究人员将TUBB8 S176L 和D417N突变型RNAs显微注射入人类胚泡期的卵母细胞，结果显示纺锤体的组装严重或者彻底受损（图4C）。与小鼠卵母细胞用相同方式处理，结果一致。