CRISPR应用指南：选择哪一种Cas9？

  CRISPR/Cas9的出现使得人们能够高效地开展精确而靶向的基因组修饰。这其中的关键组分Cas9经过修饰，能够敲除、活化、抑制甚至是成像你感兴趣的基因。不过，目前有这么多种Cas9可供选择，你一定又开始犯愁。别急，让Addgene的专家来帮帮你。
  首先，让我们来想想实验的目的吧。你希望永久敲除一个基因，还是希望降低特定基因的表达，而并非永久性地修饰基因组？激活特定位点是不是更有意义？还是，修饰表观基因组？这些问题的答案将决定了你的实验需要哪种Cas9。
  基因敲除选哪个？
  标准的SpCas9
  通过共表达目的基因特异的gRNA和核酸内切酶Cas9可创建敲除的细胞或动物。基因组目标可被任何~20个核苷酸的DNA序列靶定，前提是它满足两个条件：1) 序列在基因组中是独特的；2) 目标在间隔相邻基序（PAM）的上游。当基因组中有适合的目标位点，并且不太在意脱靶效应时，SpCas9是合适的选择。
  关心特异性？
  设计适当的gRNA序列，能增强Cas9介导的切割的特异性。不过，人们也利用多种方法来进一步增强Cas9的特异性。例如，Cas9通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH来产生双链断裂，Cas9-nickase（Cas9n）就利用了这一点。它将两个关键残基中的一个转换成丙氨酸（D10A或H840A），形成了Cas9切刻酶。目标位点上需要两个正确识别的Cas9n分子，才能产生双链断裂，这与野生型SpCas9相比大大增强了特异性。
  尽管Cas9n无疑比SpCas9更加特异，但它仍然可能与脱靶位点结合，导致插入缺失。为了克服这个限制，人们使用失去核酸酶活性的Cas9（dCas9），将其与非特异性的内切核酸酶FokI融合。FokI只在二聚化时切割目标DNA。因此，只有当两条dCas9-FokI分子正确靶定目标序列，切割才会发生。
  Cas9n或dCas9-FokI方法的一个明显局限在于它们都需要两个适当的目标序列足够靠近，才能有效地产生双链断裂。一些实验室则利用结构生物学来鉴定Cas9切割脱靶位点的关键残基，包括Broad研究院的张锋实验室和麻省总医院的Keith Joung团队。与野生型的SpCas9相比，“增强型Cas9”（张锋）或“高保真Cas9”（Joung）的切割活性相当，但脱靶活性大大降低。
  基因活化选哪个？
  Cas9的独特之处在于它结合DNA的能力和切割DNA的能力是独立的。换句话说，即使切割DNA的能力被破坏掉，它仍然能够与目标DNA结合。此外，失去核酸酶活性的Cas9（dCas9）可作为一个平台，向特定的DNA位点带去不同的货物。这种特性把各种蛋白带给目的基因，包括转录激活因子和抑制因子。
  抑制目的基因
  早期使用dCas9的实验已表明，让dCas9针对转录起始位点就足以“压制”转录。不过，在哺乳动物的细胞中，需要让带有转录抑制因子的dCas9靶定目的基因的启动子区域，才能实现可靠的抑制。如果目的基因的敲除对细胞有毒性，那么你可能需要考虑基于dCas9的抑制，包括dCas9-KRAB。Addgene提供多种质粒，抑制各个物种和细胞类型中的目的基因。
  活化目的基因
  基于dCas9的激活因子却是完全不同的。最简单的激活因子是指dCas9与单个转录激活域（通常是VP64）相融合。最近，第二代的激活因子也被开发出来，利用不同的方法改变基因表达。例如，“SunTag”系统通过dCas9和抗体活化融合蛋白的共表达，将多个激活域招募到同一个基因位点。Synergistic Activation Mediator复合物则包含dCas9-VP64融合和修饰的gRNA，后者能够与其他的RNA-结合转录激活因子相互作用。
  下一步做什么？
  如果你已经选择了适当的Cas9，恭喜你！下一步做什么呢？这里有一些注意事项，也许对你的CRISPR实验有帮助。
  设计或选择一个gRNA – 对于你感兴趣的目的基因，一些公司提供了经过验证的gRNA。这些gRNA已经成功应用在实验中，并发表在同行评审的期刊上，在你刚开始着手CRISPR实验时，它们能节省不少的时间和成本。如果你的实验需要新的gRNA，那么可以选择空的gRNA载体，并利用免费的gRNA设计程序设计你的gRNA靶向序列。
  不过，选择适当的Cas9只是实验成功的一半，你还需要选择适当的表达系统，并将Cas9导入目的细胞。目前市场上有各种含Cas9的质粒，可用于不同物种的表达，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物等。对于难转染的细胞，你可能需要考虑用慢病毒将Cas9导入细胞内。当然，导入mRNA和蛋白质也是另一种选择。
  验证你的基因组编辑 – 一旦将Cas9和gRNA导入细胞，现在是时候确认你的目标序列是否得到了修饰。具体操作可能有所不同，这取决于特定的实验。之后我们会详细介绍。
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