CRISPR功能研究入门指南（CRISPRa）

  基因组测序让我们意识到，人类基因组只有一小部分被翻译成蛋白质。其实我们基因组的80%会转录成RNA，但这些转录本大多不生成蛋白质。近年来人们发现非编码RNA往往与人类疾病有关，不过绝大多数非编码RNA的功能还是未知的。CRISPR/Cas9在这方面可以起到重要的作用。
  CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特别适合分析非编码RNA的具体功能。虽然越来越多的研究人员开始使用CRISPRa和CRISPRi，但它们其实还刚出炉不久。“我们都是这些技术的测试员，”加州大学的Jacob Corn说。
  最近The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南，帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。
  CRISPRa
  催化失活的Cas9（dCas9）连上转录激活子，可以有效促进基因组特定位点的转录，这一工具被称为CRISPRa。
  cDNA过表达是上调个别基因的表达水平的常用方法。与这种方法相比，CRISPRa使用起来更加简单，而且可以同时激活多个基因。未来CRISPRa将正在成为RNA研究的金标准，加州大学的Mitchell O’Connell指出。O’Connell在CRISPR先驱Jennifer Doudna的实验室从事博士后研究。
  目前CRISPRa已经发展出好几个新版本。MIT的CRISPR先驱张锋通过改造dCas9和sgRNA优化了转录机器的招募，成功将RNA表达水平提升了一个数量级。此前研究者们是把活化转录的结构域连接在dCas9的末端，但这种系统往往不能持续启动基因转录。张锋及其同事解析了dCas9、sgRNA和目标DNA结合时的分子结构，并以此为基础进行了改良。他们发现，RNA从Cas9复合体伸出的两个小环是更好的连接位点，这样活化结构域在招募转录机器时就更加灵活。张锋团队用自己的改良版CRISPRa激活了十个基因。研究显示，这些基因的转录都得到了两倍以上的增涨，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。
  张锋实验室还找到了利用CRISPRa控制基因转录水平的新途径。他们发现，CRISPRa离转录起始位点越近，转录激活的效果就越强。如果CRISPRa靶向转录起始位点的上游（超过200bp），触发的转录就会更为温和，更接近生理水平。张锋实验室的博士后Silvana Konermann介绍道。在一项还未发表的研究中，她通过这一途径揭示了基因表达量与表型强度之间的线性关系。
  加州大学的Jonathan Weissman也在开发转录激活子并建立相应的规则。他的研究团队在dCas9上融合了一连串短肽（也就是SunTag array），这些短肽相当于一套分子挂钩，能在细胞中招募多拷贝的转录激活子，生成强劲的信号（Cell, 159:647-61, 2014）。“我们现在就在使用这个系统，”Corn说。“这是一套完整的体系，我们招募转录激活子，也很清楚它们的使用规则。”
  哈佛大学的著名遗传学家George Church也构建了改良版的CRISPRa。人们在基因表达研究中，主要还是一次针对一个基因。Church领导的研究团队将三个活化结构域（VP64、p65、Rta）连接起来，然后融合到dCas9的末尾。研究显示，Church的系统可以揭示一连串基因回路对生物过程的影响，也可以精确指导干细胞分化，生成再生医学所需的移植器官。研究人员用自己开发的技术诱导干细胞分化成大脑神经元。他们发现，Cas9在编程神经元发育时比传统方法好40倍。Bassett指出，在自己使用新一代CRISPRa的过程中，Church这个系统的成功率最高。与Weissman、张锋的CRISPRa不同的是，Church的系统目前还没有用于大规模功能获得性筛选。
  至于哪个版本的CRISPRa最终能够脱颖而出，专家们认为现在下结论还为时尚早。在自己的研究领域多尝试几种方法是没有坏处的，更新更好的方法可能也即将问世。“摸索CRISPRa在不同研究中的应用是我们每一个使用者的义务，”Corn说。
  现在大多数研究是在既定细胞系中使用CRISPR，而哥伦比亚大学的Uttiya Basu准备将CRISPRi和 CRISPRa用于初级免疫产生的混合细胞。这是一项很有挑战性的工作，“不同类型的细胞有着不同的摄取能力，”Basu说。“而且初级免疫细胞会在一段时间后死亡，”导入CRISPR系统是有时间限制的。
  近年来，CRISPR技术如风暴一般席卷了生物学领域，它本身也在不断的更新换代。现在，CRISPR–Cas9系统已经不只是简单的基因组编辑工具。斯坦福大学的齐磊（Lei Stanley Qi）和加州大学旧金山分校的Wendell A. Lim教授在Nature Reviews Molecular Cell Biology杂志上发表综述文章，探讨了CRISPR–Cas9在基因组编辑以外的技术发展和广泛用途。Wendell A. Lim和齐磊都是CRISPR领域的先行者，在Cell等顶级期刊上发表了多项突破性成果。
（转化医学网360zhyx.com）