Nature子刊：新型CRISPR大片段基因敲入技术

  由日本大阪大学医学研究生院实验动物科学研究所副教授Tomoji Mashimo，及日本信息与系统研究组织国立遗传学研究所小鼠基因组学资源实验室助理教授Kazuto Yoshimi领导的一个研究小组，开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP(two-hit two-oligo with plasmid)）。这两种方法利用了CRISPR-Cas系统和ssODN（单链寡核苷酸）。他们的研究论文发布在近期的《细胞通讯》（Nature Communications）杂志上。
  CRISPR-Cas系统使得对小鼠和大鼠进行基因改造变得很容易。通过导入Cas9信使RNA和gRNA，gRNA可以识别靶DNA，Cas9则会切割靶位点。然后通过可引起DNA突变的非同源末端连接来修复DNA断裂，就能够实现基因敲除。
  同样，当导入ssODN和Cas9-gRNA时，可通过同源介导的修复（HDR）利用供体DNA来修复DNA断裂，敲入一到几十个碱基（bp）的DNA序列。虽然ssODN允许合成长达200 bp的寡核苷酸，这使得敲入诸如绿色荧光蛋白（GFP）一类的大片段DNA序列变得困难。
  在这项研究中，研究人员结合了ssODNs与CRISPR-Cas系统化微调。他们首先将多聚腺苷酸尾（poly(A)）添加到表达Cas9 mRNA的质粒上，用这一CRISPR-CasCRISPR-Cas系统提高基因编辑的效率。利用Cas9-poly(A)，他们采用了两种方法来完成相对较长的DNA片段，如GFP序列的靶向基因敲入。第一种方法利用长ssODNs (lsODNs)作为靶向供体。第二种方法涉及共同注射两个gRNAs作为“剪刀”切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点，两个短ssODNs作为“浆糊”连接切割位点的末端。
  利用开发出的两种基因改造方法，该研究小组成功实现了高效、精确敲入GFP基因，导入了近200kbp的大片段基因组区域（这是采取传统方法不可能做到的），并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物。
  这两种基因敲入方法将会提高在小鼠、大鼠和其他各种生物物种中进行遗传工程改造的效率，将成为构建新遗传工程生物的有用技术。研究人员高度期待这些遗传工程生物将用于药物研发、转化研究和再生医学等广泛的研究领域。
  基因敲入是指利用随机整合、转座子系统、同源重组等方式将外源功能基因插入到基因组中，使其在细胞内进行表达的基因编辑技术。利用CRISPR/Cas技术可以实现外源基因的定点敲入，使遗传背景更为简单，实验操作更加精准、高效。（原文：ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes）
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