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腾讯登录单细胞技术新突破：在单细胞水平实现蛋白与RNA的同时检测
| 导读 | 单细胞分析技术有很广的范畴，包括进行核酸水平检测的各种单细胞测序及PCR技术，还有进行蛋白水平检测的质谱流式等等。迥异的检测技术手段使我们很难同时对单细胞的核酸和蛋白进行高通量的检测。2015年底，随着《Nature methods》一篇文章的发表，这种情况成为了历史。 |
单细胞分析技术有很广的范畴，包括进行核酸水平检测的各种单细胞测序及PCR技术，还有进行蛋白水平检测的质谱流式等等。迥异的检测技术手段使我们很难同时对单细胞的核酸和蛋白进行高通量的检测。2015年底，随着《Nature methods》一篇文章的发表，这种情况成为了历史。
引发这一技术突破的是美国斯坦福大学的Garry Nolan实验室，他们成功的将PLA （proximity ligation assay）技术运用到单细胞的RNA检测，即PLAYR（proximity ligation assay for RNA）。这样，科学家可以用质谱流式（Mass Cytometry）检测数百万单细胞的基因表达。更重要的是，这一检测方法与现有的质谱流式的蛋白检测方法是兼容的，因此可以实现对单细胞进行蛋白、核酸的同时检测。
可以看出，只有当两个目标探针都正确结合时，最终生成的探针复合体才能够被连接，这样做可以大大提升检测的特异性；研究小组进一步解释道，如果为同一目标RNA设计多对探针，会进一步增加特异性和灵敏度，同时也可以避免一些蛋白对RNA某些区段的封闭所造成的影响。他们建议对一个目标RNA同时设计4~5对目标探针，这样就可以同时满足高表达和低表达RNA检测的需要。
用来检测样本的质谱流式，是近些年来快速兴起的单细胞分析技术。其原理就是利用带有金属元素标签的抗体、染料、探针来标记细胞，然后使用ICP-TOF对这些细胞进行逐个检测，从而得到大量单细胞的多参数数据。目前可用来标记探针的金属标签有三四十种，由于质谱流式实际可以检测的通道数量有135个，随着未来更多新标签种类的开发，其可以同时检测的RNA数量还会继续提升。
PLAYR的出现就像打开了一扇新的“窗口”，通过它研究者可以看到不一样的“风景”。比如，我们可以直接用质谱流式检测一些非编码RNA的表达；对于一些没有相应流式抗体的蛋白，我们依然可以利用PLAYR检测其RNA的表达。此外，利用大量探针来代替抗体，还有可能帮助研究者降低实验成本。
在下面的例子中，研究者利用质谱流式检测了15个ESC 分化相关蛋白的RNA水平，并对其进行了亚群分析。
值得一提的是，Lncent1实际上是一个与细胞多能性相关的长链非编码RNA，我们可以很清楚的看出它主要表达在mESC中。
PLAYR的亮点还在于与蛋白检测的兼容性。研究人员成功解决了RNA检测和蛋白检测在方法学上的矛盾。在实验过程中，可以先用抗体对胞内外蛋白进行标记，然后在用PLAYR流程对RNA进行原位扩增和标记。我们可以根据表面Marker对细胞进行亚群分析，深入研究每个亚群中信号通路、转录因子的激活及其相关基因的表达（如下图所示）。
另外，RNA和蛋白的同时检测也让研究人员有了一些意外的发现。“人人都知道，‘RNA表达水平等同于蛋白表达水平’只是一个假设”Garry Nolan说道，“我们的结果展示了几乎所有可能的对应关系，有些细胞只有蛋白存在却没有对应的RNA，有些细胞有RNA却没有对应的蛋白。很明显，细胞中还有很多转录和翻译的调节机制需要我们深入研究。”
引发这一技术突破的是美国斯坦福大学的Garry Nolan实验室，他们成功的将PLA （proximity ligation assay）技术运用到单细胞的RNA检测，即PLAYR（proximity ligation assay for RNA）。这样，科学家可以用质谱流式（Mass Cytometry）检测数百万单细胞的基因表达。更重要的是，这一检测方法与现有的质谱流式的蛋白检测方法是兼容的，因此可以实现对单细胞进行蛋白、核酸的同时检测。
PLAYR技术原理
PLAYR包括杂交、连接、滚环扩增和检测四个阶段。杂交分两阶段进行，如图中2和3中，针对目标RNA两个相邻区段的探针（后面称目标探针）分别于目标结合后，再与Backbone和Insert两个探针进行杂交。连接后，Backbone和Insert探针形成一个环，做为后续滚环扩增的模板。随后的扩增使用的是phi29聚合酶，处理好的样本用带有金属标签的探针标记后就可以在质谱流式仪上检测了。可以看出，只有当两个目标探针都正确结合时，最终生成的探针复合体才能够被连接，这样做可以大大提升检测的特异性；研究小组进一步解释道，如果为同一目标RNA设计多对探针，会进一步增加特异性和灵敏度，同时也可以避免一些蛋白对RNA某些区段的封闭所造成的影响。他们建议对一个目标RNA同时设计4~5对目标探针，这样就可以同时满足高表达和低表达RNA检测的需要。
用来检测样本的质谱流式，是近些年来快速兴起的单细胞分析技术。其原理就是利用带有金属元素标签的抗体、染料、探针来标记细胞，然后使用ICP-TOF对这些细胞进行逐个检测，从而得到大量单细胞的多参数数据。目前可用来标记探针的金属标签有三四十种，由于质谱流式实际可以检测的通道数量有135个，随着未来更多新标签种类的开发，其可以同时检测的RNA数量还会继续提升。
PLAYR的出现就像打开了一扇新的“窗口”，通过它研究者可以看到不一样的“风景”。比如，我们可以直接用质谱流式检测一些非编码RNA的表达；对于一些没有相应流式抗体的蛋白，我们依然可以利用PLAYR检测其RNA的表达。此外，利用大量探针来代替抗体，还有可能帮助研究者降低实验成本。
在下面的例子中，研究者利用质谱流式检测了15个ESC 分化相关蛋白的RNA水平，并对其进行了亚群分析。
质谱流式对小鼠胚胎干细胞的分析（viSNE图）
（总共检测了15个mESC相关RNA，包括一个no-coding RNA---Lncenc1）
图中所示的分析方法叫做viSNE，是一种基于生物信息学的亚群分析方法，它可以对质谱流式数据进行“降维处理”，实现质谱流式数据的直观展示。 图中每个点都代表一个细胞，点之间相对距离的大小反映了它们的相似程度。细胞被分为了三个亚群，我们可以直观的观察每个亚群中的细胞异质性。值得一提的是，Lncent1实际上是一个与细胞多能性相关的长链非编码RNA，我们可以很清楚的看出它主要表达在mESC中。
PLAYR的亮点还在于与蛋白检测的兼容性。研究人员成功解决了RNA检测和蛋白检测在方法学上的矛盾。在实验过程中，可以先用抗体对胞内外蛋白进行标记，然后在用PLAYR流程对RNA进行原位扩增和标记。我们可以根据表面Marker对细胞进行亚群分析，深入研究每个亚群中信号通路、转录因子的激活及其相关基因的表达（如下图所示）。
质谱流式对人PBMC细胞的分析
（细胞用LPS刺激，同时检测16个表面Marker、2个信号通路蛋白、8个Cytokine的RNA；）
一般来讲，如果想检测单细胞内Cytokine的表达，就需要用药物阻止Cytokine的分泌，使其积累在细胞内增强信号水平，这种处理本身实际上对细胞有一定影响的。另外，由于需要等待数个小时，这使得我们及时无法获得一些的蛋白磷酸化或者转录因子表达等数据。有了PLAYR技术，这些问题都可以得到有效的解决。另外，RNA和蛋白的同时检测也让研究人员有了一些意外的发现。“人人都知道，‘RNA表达水平等同于蛋白表达水平’只是一个假设”Garry Nolan说道，“我们的结果展示了几乎所有可能的对应关系，有些细胞只有蛋白存在却没有对应的RNA，有些细胞有RNA却没有对应的蛋白。很明显，细胞中还有很多转录和翻译的调节机制需要我们深入研究。”
不难看出，PLAYR极大的拓展了质谱流式的应用范围，研究者可以更加灵活的设计自己的实验，更加深入的研究动物模型或者病人样本。实际上，它正在搭建连接“单细胞蛋白质组”与“单细胞转录组”的桥梁，这对于血液、免疫、癌症、干细胞等等诸多研究领域都有十分重要的意义。
（转化医学网360zhyx.com）
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