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腾讯登录单细胞组学在肿瘤与免疫研究中的应用
| 导读 | 17世纪，在普鲁士的王宫里，大哲学家莱布尼茨在向众人宣传他的宇宙观时，曾经大胆的提出：“宇宙间没有两个东西是完全相同的”。此语一出，众皆哗然，有人立即去王宫的花园中试图找到两片完全相同的叶子，结果却令在场的所有人大失所望。事实上，不仅仅是叶子，即便微小如构成生物体的每个细胞，其形态和功能都不尽相同。 |
17世纪，在普鲁士的王宫里，大哲学家莱布尼茨在向众人宣传他的宇宙观时，曾经大胆的提出：“宇宙间没有两个东西是完全相同的”。此语一出，众皆哗然，有人立即去王宫的花园中试图找到两片完全相同的叶子，结果却令在场的所有人大失所望。事实上，不仅仅是叶子，即便微小如构成生物体的每个细胞，其形态和功能都不尽相同。
一花一世界，一叶一菩提一、单细胞研究方兴未艾
细胞是构成生命体的结构和功能的基本单位，不同类型的细胞形态迥异，功能也各不相同。即使是同类细胞间看似相同，相互间也存在着广泛的细胞异质性。
在传统研究中，对于细胞或分子水平的大多数分析检测方法，都是建立在群体细胞基础上的。早期这类方法能更快速方便的获得大量数据并利于进行有效的统计学分析，但是随着研究的深入，这种基于群体细胞分析所获得的平均性数据，往往忽略了细胞个体间差异，在很大程度上掩盖了不少稀有、微量样本的作用以及在生命体内广泛存在的随机行为，“平均”结果带来的数据缺失，甚至是与事实相反的错误结果，都是基于群体分析无法避免的结果。而针对单细胞水平的细胞异质性研究，则在很大程度上弥补了这一漏洞，逐渐成为科学家们关注的重点。
今年3月8日，科技部下发了《国家重点研发计划2016年度项目申报指南》的通知，其中“精准医学研究”作为其中之一被列入优先启动的重点专项，指南中明确提出：要通过对单细胞组学技术的研发，建立单细胞的高通量快速分离、捕获、提取及测序技术；从而深入推进单细胞技术在重大及罕见疾病临床研究和治疗中的应用。作为上述研究的目标和基础，建成“单细胞捕获富集技术”、“单个细胞基因组的均匀、无偏、精准扩增和高通量测序技术”和“整合的单细胞多组学高通量测序技术”等内容被名曲的提出将作为项目的考核指标，相关领域研究在未来五年将受到国家重点扶持。
随着科技的发展，人类基因组计划的推进，特别是单细胞测序技术突飞猛进的发展，越来越多的证据显示，基于单细胞基因组学和蛋白组学的研究，能够提供前所未有的临床和科研大数据，帮助科学家们更准确更深入地了解生物体的生理和病理机制，例如干细胞的分化、神经细胞的发育，癌细胞的病变机理，免疫细胞的功能等等，并指导临床医学转化及重大疾病的治疗防控。
二、单细胞研究在肿瘤及免疫中的应用
肿瘤与免疫是生物体内最复杂的生理环境。越来越多的证据表明，肿瘤的发生及发展和免疫系统功能的失调有着密切的关系。在肿瘤环境下，无论是肿瘤细胞还是免疫细胞，都存在着大量的特异性突变位点或表面标记物，理论上用这些位点和标记物可以进行非常针对性的个体化治疗。但事实上要想实现这一目标并不容易。生物体内广泛存在的细胞异质性，相关因子表达的时效性、动态变化过程等，都严重影响着治疗方案的有效性。
例如在临床诊断和治疗上，即使是处于同一阶段的同一种肿瘤，不同的患者间细胞内基因和蛋白的表达也有可能完全不同。即使是同一个病人体内，表达水平也是呈现持续动态变化的，在不同时期或肿瘤组织的不同部位，很可能有着很大的差异。只有对差异了解的越清楚、对过程研究的越透彻，才越有可能开发出更有效的个体化治疗药物或手段。
目前个体化免疫治疗和精准医疗的方法，多是基于生物体自身免疫系统功能基础的抗体药物的研制、免疫细胞治疗（如CAR-T）、肿瘤疫苗的开发等研究，关键步骤之一就是找到特异性的靶点。例如PD-1与PD-L1间的相互作用促成了多种抗肿瘤药物的上市，针对CD19的CAR-T疗法已经在临床上取得了明显的疗效，但是研究中找到这样的靶点非常困难。斯坦福大学的Garry Nolan教授指出，有些因子看似平常，但是在肿瘤环境中，他们有时候不是独立表达而是成簇存在的，并且随癌症种类的不同组分也会有所变化。如何利用这样的特异性排列组合来构建有效的多功能抗体、CAR、甚至是TRACK，这需要通过大量实验检测，积累大批数据，并在大数据的基础上进行合理有效的数据分析，再不断通过实验验证，这是非常繁琐的过程，通常会消耗大量的人力物力。
另一方面，免疫系统本身就是一个非常复杂的体系，传统方法下科学家们多是关注免疫系统或某类免疫细胞的整体功能。今天，单细胞研究使科学家们可以从另一个角度来认识这个复杂的网络系统。《Nature Immunology》最近发表了瑞典卡洛林斯卡学院的科学家Sandberg和Mjösberg的团队的研究成果：通过对数百个扁桃体细胞进行单细胞基因测序后，发现并确定了三个先天淋巴细胞ILC3s的亚群；这三个亚群在基因表达水平上具备明显的区别，同时对信号因子的诱导反应能力和蛋白分泌能力也存在着差异（Björklund ÅK, et al. 2016）。随着研究手段的升级，数据结果的积累，相信人类对自身免疫系统的认识会越来越透彻，从而为临床治疗提供丰富的信息。
从临床角度讲，肿瘤发现的越早越容易治愈，患者5年生存率也越高。因此，建立有效的预防检测手段，防患于未然，也是科学家和临床工作者另一个努力的方向。CTC作为特异性的肿瘤组织转移的标记物，虽然还没有别用于实际的临床检测中，却越来越受到人们的重视。但是由于其在血液中的含量极低，同时又呈现了高度的细胞异质性（Alix-Panabieres 2014），造成研究过程的困难。哈佛大学医学院Toner实验室开发了一种可以从癌症病人全血中分离循环肿瘤细胞的装置，并利用Fluidigm的BioMark HD 平台对分离出的单细胞进行基因表达异质性分析，这一研究有力的推进了CTC分析在癌症临床检测及监测中的应用(Ozkumur et al)。事实上，单细胞水平的分析检测，使人们能够更清楚的深入分析CTC细胞中基因的特异性表达，为临床上肿瘤转移的早期识别，个体化治疗手段的开发提供了大量有价值的数据基础。
工欲善其事，必先利其器新技术的开发和应用是科研突破的必要条件
随着二代测序技术的日趋成熟和相关仪器的快速发展，单细胞测序已经逐渐成为广泛使用的实验手段之一，但其上游实验流程--高通量样本制备一直是限制单细胞研究发展的一大瓶颈。在日常研究中，从捕获的单细胞内提取DNA是一项繁琐而且非常耗时的工作，且单个细胞中的DNA含量极低（通常只有6pg），对后续的单细胞基因组测序、表达谱分析等实验有着极大的限制。
针对单细胞研究中难于快速捕获大量单细胞，制备过程复杂繁琐、变量多，低样本量难以满足后续检测等难题，Fluidigm（富鲁达）公司基于微流控芯片技术开发的C1系统，在纳升级的反应仓内，将单细胞捕获、裂解、反转录、预扩增等自动化流程一气呵成，经过扩增后的样本量也可以满足单细胞测序、RT-PCR等后续实验的要求。同时针对实验中越来越高的单细胞数量要求，进一步开发了高通量芯片类型，可一次性地捕获制备800个单细胞的基因组样本，大大降低了实验的复杂性和成本。
事实上，成功的文库制备是获得良好测序结果的前体和保障，如何充分利用样本进行多组学平行测序一直是科学家们研究的方向之一。前不久《Cell Research》发表了由北京大学生科院汤富酬组、黄岩谊组与北京世纪坛医院彭吉润组的合作成果，在国际上首次实现了单细胞水平对基因组、转录组和表观组的平行测序。利用这一新的方法，作者对肝癌患者病灶组织中的25个肿瘤细胞进行了三重组学的平行测序分析，根据结果将25个单细胞分为了两个细胞亚群。并对这两个亚群的基因表达量、拷贝数变异（CNV）和甲基化程度进行了差异化分析，发现其中CNV和甲基化水平都较高的一组细胞更易发生转移（Hou Y., et al.），从而为肿瘤的个性化精准治疗提供了大量数据基础。
最近Fluidigm公司又在C1基础上推出了Polaris系统，该系统利用荧光标记定向筛选、捕获单细胞，并可在最长至24小时的外源因子刺激后，进一步完成上述预扩增过程。利用这一技术平台，科学家们可以精确控制或模拟细胞微环境，并对处于该环境中的单细胞进行观察和测序分析，了解哪些是涉及细胞与环境、细胞与细胞间相互作用的关键基因--这对识别不同的基因簇，发现罕见的基因表型非常重要除了在单细胞基因分析检测方面有了突飞猛进的发展，在一些传统领域，例如单细胞蛋白分析技术也有了重大的突破--质谱流式细胞技术（CyTOF）的开发，大大拓宽了流式分析技术的应用领域。该技术利用金属原子代替传统流式技术中的荧光基团标记抗体，具备背景噪音低、通道间无干扰、超高检测通道数（目前为135个）等优势。在此基础之上Fluidigm公司进一步开发的IMC 技术（imaging mass cytometry），可以实现病人组织样本切片中几十个蛋白的原位检测。这种直接利用病理切片的流式检测方法，在快速分析大量单细胞的同时，还可进行多维数据分析，以寻找不同亚群的分布和异质性与肿瘤微环境间的相互作用，无疑为临床治疗提供了可靠的数据，并为个体化精准医疗方案的制定提供了指导方向。
结语：欲穷千里目，更上一层楼科学研究的发展，重大成果的取得，离不开技术手段的改进和创新。在积累了大量群体“平均”数据的基础上，创新性的单细胞组学研究必将使科学家们更加全面和深刻的理解生物体的本质及其内部所蕴含的生理机制，更好的为临床研究和治疗诊断服务。
作为硅谷一家专门致力于单细胞研究技术开发的公司，Fluidigm（富鲁达）公司一直保持和行业同步发展，不断开发创新性产品，优化已有仪器和配套技术，实现从基因到蛋白再到细胞的全方位检测，为科研工作者提供更加完善的单细胞研究平台。
参考文献
1.《科技部关于发布国家重点研发计划精准医学研究等重点专项2016年度项目申报指南的通知》，20162.Björklund ÅK, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Immunol. 2016.
3.Alix-Panabieres C, Pantel K. Technologies for detection of circulating tumor cells: facts and vision. Lab Chip 2014;14: 57-62.
4.Ozkumur et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci Transl Med 5, 179ra47 (2013)5.Hou Y., et al. Single-cell triple omics sequencing reveals genetic, epigenetic, and transcriptomic heterogeneity in hepatocellular carcinomas. Cell Res. 2016 Mar;26(3):304-19.（转化医学网360zhyx.com）
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