干货！一文读懂液态活检研究进展及技术平台

  液态活检（liquid biopsy）

  液态活检这一概念最早在1974年由Sorrells等提出。液态活检主要检测对象包括：循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）以及肿瘤外泌体（exosome）等，它们来源于肿瘤组织，存在于血液，可以提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗。与现有肿瘤检测方法相比，液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势，应用发展潜力巨大。从成本的角度，医疗保险有较大的动力推动液态活检的CTC与ctDNA技术对穿刺活检技术的替代。癌症液态活检也将帮助削减无效医疗开支、降低医疗成本、帮助医保控费。
  美国纪念斯隆-凯特林癌症中心主任医师兼首席医疗官约瑟·巴塞戈称：“液态活检可能永久改变活检方式，包括对治疗方案的响应、抗药性的出现，将来甚至还能用于早期诊断”。2015年2月白宫官网发布的相关细节中，肿瘤治疗计划的四大举措之一就是：美国将使用“液态活检”血浆开发新方法来评估治疗反应以及抵抗可能的耐药性。
  根据中国国家癌症中心发布的数据，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万。液态活检临床实验的适应症广泛，如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、食管癌等常见肿瘤均可用液态活检技术进行诊断与监测。在我国存量肿瘤患者中，适合使用液态活检技术的肿瘤病人至少为542万人，占比达到72%。预计液态活检的目标患者人数为500万人。在同时考虑我国肿瘤发病率、液态活检适应症、未来市场渗透率、未来检测单价以及患者年平均检测次数等因素后，预测中国液态活检市场在5-10年内的市场潜力约为200亿元。
  另外，由于血液中肿瘤DNA的量与肿瘤的大小和阶段大致成比例，这种检测也可用来判断手术或药物治疗的效果。对于组织活检难以进行的疾病，如肺癌，液态活检特别有用（图1）。

  图1. 液态活检在肿瘤（肺癌）中的应用

  一、液态活检之循环肿瘤DNA研究进展及技术平台简介
  （一）循环肿瘤DNA （ctDNA）简介
  血浆游离循环肿瘤DNA（ctDNA）是由肿瘤细胞释放到血浆中的单链或者双链DNA，对ctDNA进行检测，可以对肿瘤负荷进行实时监控、药物疗效反应与预后判断等。肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液当中（图2）。虽然这些DNA是断裂的，不完整的，但它来自于肿瘤细胞，如果肿瘤细胞携带某种基因突变，这些突变也能在ctDNA中反应出来。通过检测ctDNA的基因突变，就可以揭秘体内肿瘤组织的突变信息，从而为肿瘤的靶向治疗和药效检测提供依据。

  图2.循环肿瘤DNA（ctDNA）的来源

  ctDNA可能比蛋白质生物标识表现得更好。蛋白质被用于临床疾病诊断，并对正在接受治疗的患者进行监控。例如，前列腺特异性抗原（PSA）是前列腺肿瘤的生物标识，但它却会出现假阳性结果，因为出于其他原因，这种抗原在血液中的含量也会升高。但ctDNA出现假阳性的几率更低，因为它是由具有癌细胞印记的突变和其他遗传变化定义的。尽管大多数蛋白质生物标识能在血液中存在数周，而ctDNA的半衰期不到两个小时，因此，后者呈现的是肿瘤实时的情况。剑桥团队与约翰斯·霍普金斯团队分别发现，在监测乳癌和肠癌时，与蛋白质生物标识相比，ctDNA更加敏感，并且在追踪肿瘤消失、扩散和复发时，ctDNA也更准确。另外，这两个小组还发现，ctDNA比循环肿瘤细胞更敏感。在实验中，Diaz研究小组发现，当两者都存在时，ctDNA碎片在数量上要超过循环肿瘤细胞（50：1）。在过去十年，高通量测序技术（又称为二代测序技术）迅速发展，并成功应用于遗传性疾病及肿瘤的诊断。如能将高通量测序技术运用在液态活检上，将为分子诊断开拓一个更为广阔的天地。高通量测序检测ctDNA技术只需要少量的外周血，就可以检测出肿瘤DNA中的突变。
  由于ctDNA的二代测序检测准确、灵敏、无创且高通量，目前已用于靶向治疗的实时监测。英国癌症研究所Bono实验室发表在《临床癌症研究》（ClinicalCancer Research）上的文章报道了ctDNA的二代测序检测在监测靶向药物疗效中的应用。该研究来自一个针对PI3K-AKT-mTOR信号通路的靶向药物的临床实验，共39位癌症患者参与此项研究，在服药前已有不同程度的癌细胞转移迹象。首先，该研究证明外周血ctDNA中检测到的突变均在手术活检样品中出现，说明ctDNA可以反应肿瘤组织分子水平变化。

  图3.循环肿瘤DNA（ctDNA）测序

  接下来，在服用靶向药物过程中，每隔一段时间收集外周血进行ctDNA测序，用以监控上述信号通路中的热点突变的变化，从而为判断药物的疗效提供依据，结果显示，ctDNA突变的变化趋势与传统CT检测到的肿瘤大小变化基本一致，实现了肿瘤分子水平监控。靶向药物针对基因突变而设计，因此ctDNA中的突变变化可以更灵敏准确地判断靶向药物的疗效。
  （二）ctDNA研究进展
  当前的分子诊断技术主要还是基于细针穿刺，其面临的技术局限是灵敏度问题。由于肿瘤的异质性，细针穿刺所取到的少量样本往往无法反映肿瘤突变的全貌，也可能会遗漏恶性的亚克隆。某些实体瘤如肺癌，穿刺取样存在困难和风险。所以，采用无创检测手段对血液中的ctDNA进行检测和测序，可以帮助人们通过取血得到更全面的癌症信息，告诉医生治疗是否已经起作用，肿瘤有没有演化出抗性2,3。研究发现，在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌等人类恶性肿瘤中均能检测到ctDNA。目前针对ctDNA的研究主要包括以下四个方面：
  1. 追踪肿瘤进化
  2015年发表于《NatureCommunications》杂志的一项新的研究，科学家首次发现，流进入血液中的肿瘤DNA，可用于实时跟踪肿瘤的发展以及对治疗的响应4。
  剑桥大学的研究人员从肿瘤已经扩散到身体其他部位的一名ER、HER-2阳性的乳腺癌患者身上，在患者治疗期间采集了8份肿瘤样本（图4-1）和9份血液样本进行外显子组和靶向扩增子测序。他们仔细研究了进入血液中的、来自死亡肿瘤细胞的小DNA片段，并将它们与在同一时间点上采集的活组织切片进行比较。

  图4-1.采集肿瘤样本（活检部位）

  结果表明，血液样本中的ctDNA与活检相匹配，反映了当肿瘤发展和响应治疗时出现了相同的模式和遗传变化时机。这些结果提供了第一个原理证明，分析了血液中的ctDNA，可以准确地监测体内的癌症。使用PyClone的贝叶斯聚类分析发现8个主要的突变簇，并绘制出肿瘤进化的系统树（图4-2）。

  图4-2.肿瘤进化树

  本次研究的结果预示：在利用ctDNA实时监控肿瘤负荷方面，具有在血浆中丰度最高，在随访过程中不易丢失等优势的躯干突变基因（truncal mutations）将是最好的候选靶标。同时，药物治疗前血浆中的耐药相关的ctDNA突变可能为治疗方案的选择提供依据。
  2.耐药机制研究
  肿瘤的靶向治疗显着提升了患者的临床治疗效果，然而不幸的是大部分患者都会产生获得性治疗抵抗。阻碍临床患者治疗的一大主要问题是对于耐药机制的理解5,6。2016年发表的两项研究显示血浆游离DNA分析能够成功检测出非小细胞肺癌和结直肠癌种EGFR靶向治疗的异质性耐药机制5。

  图5.患者血浆游离DNA采集

  本研究通过对EGFR TKI AZD9291耐药的肺癌的无细胞血清DNA （cfDNA）的研究，利用高通量测序技术（next generation sequencing, NGS），发现在7个病人中有一个有EGFR C797S突变把这种突变加入肺癌细胞系中，能导致肺癌细胞对AZD9291产生耐药。随后进行了微滴式数字PCR （ddPCR），对15个经过AZD9291治疗的病人的无细胞血清DNA （cfDNA）进行了检测，发现他们在治疗之前全都有T790M突变，但是接受AZD9291治疗并耐药后，6个病人产生了EGFR C797S突变，5个病人保持了T790M突变但是没有C797S突变，4个病人失去了T790M突变，但是依然有EGFR通路的激活7。该研究表明，在治疗初期的克隆会随着时间波动，无细胞血清DNA （cfDNA）监测有助于肿瘤负荷的检测以及治疗反应的判断。
  3.  预后评估
  2013年发表于《新英格兰杂志》一篇研究报道：在对30名转移性乳腺癌肿瘤患者检测中，97%可成功检出ctDNA；78%可检出CA 15-3，87%可检出循环肿瘤细胞8-10。ctDNA水平显示出动态范围以及与肿瘤负荷的关联性均大于CA 15-3或循环肿瘤细胞（CTC）。ctDNA为53%的患者提供了最早的治疗反应监测指标。该研究表明，ctDNA携带肿瘤特异性变异，与现有FDA批准的生物标记物和CTC相比，能更有效监测转移性乳腺癌。
  4.药物疗效反应
  2014年发表于《Sci Transl Med 》上的一篇研究报道：对转移性结直肠癌患者治疗前后血液样本中血浆游离循环肿瘤DNA分别进行全基因组、全外显子组或者目标区域高通量测序，能够发现患者体内治疗前后的不同的基因发生了一种或多种突变，这些新出现的突变可能是导致药物耐药的原因之一11。当患者样本量积累到足够大时，可以有助于鉴定肿瘤耐药或复发相关的基因或通路。

  图6. ctDNA水平与疗效监控及预后评估

  （三）ctDNA研究策略简介
  在实体瘤患者治疗前、治疗后与随访期间按照不同时间点多次采集外周血样本，分别对血浆ctDNA进行ddPCR检测或者全外显子组、目标区域高通量测序。不同时期的外周血样本基因突变类型与基因突变频率可以反映患者在治疗期间的病情进展、对药物疗效的反应以及可能的预后信息。当患者样本量积累到足够大时，可以有助于鉴定肿瘤耐药或复发相关的基因或通路。
  （四）总结与展望
  生物标志物的发现是一个不断发展的领域，分析和诊断的敏感性需得到进一步提高，以便分析ctDNA的特定突变基因。此外关于肿瘤的异质性方面即检测出的血浆ctDNA可反映全部的不同转移部位肿瘤的突变情况还是仅代表影响疾病进展和治疗抵抗的最重要的DNA突变则有待更深入地研究17。随着技术的进步和成本的降低，全基因组测序可能成为检验医学的常规工具。同时分析血浆DNA的一系列过程则需进行标准化，并提高检测方法的敏感性18。
  如今ctDNA技术尚未运用于临床实践，许多机制尚不十分清楚11。目前临床尚未开展多中心、大样本的基础以及临床研究，缺乏有价值的科研资料来指导临床，但随着广大科研工作人员对 ctDNA的不断探索和研究，ctDNA 将可能成为临床肿瘤学中一种具有重要意义的生物标志物。综上所述，ctDNA技术作为一种方便、非侵入性、可重复性和高敏感性的“液态活检”技术，能够了解循环中肿瘤特异性突变，在肿瘤的早期诊断、疗效评估、复发和预后判断等方面发挥着重要的作用。以形态病理学为基础，以分子病理学为辅助。两者相辅相成，液态活检将为人类更深入地了解疾病的本质提供更丰富的、可靠的手段5。
  在未来，ctDNA结合ddPCR技术或者新一代测序技术将有望实现：
  1.早期筛查：在影像学未发现病灶时对被检测者进行早期筛查，判断肿瘤原发灶；
  2.实时监控：ctDNA检测作为一种无创的检测方法，能够真实的反映实体瘤组织中的基因突变图谱与频率，并且能够进一步为患者提供最早的实时监控检测指标；
  3.治疗反应：在治疗前后分别检测患者的ctDNA，可以及时检测患者体内的实体瘤相关基因的突变图谱及频率，监测患者的肿瘤负荷及对治疗的敏感性与耐药性；
  4.判断预后：在治疗前或治疗后，对患者体内实体瘤相关基因进行监测，可以评估肿瘤特异性变异的突变频率，对医生判断患者的预后起到指导作用。
  二、液态活检之循环肿瘤细胞（CTC）研究进展及技术平台简介
  （一）CTC基础知识
  1.CTC的基本概念
  1869年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并首次提出了循环肿瘤细胞（CTC）的概念1。1976年，Nowell将CTC的定义修正为：来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。上世纪90年代，科学家开始对CTC的临床意义进行研究。2000后，CTC日益成为临床上液态活检标志物的研究热点，并在临床越来越广泛的应用3,4。
  2.CTC的特点3-5
  2.1可能是单个细胞从病灶脱落进入外周血，也可能是成簇脱落；
  2.2不同CTC在形态上有较大差别；
  2.3CTC有很强的异质性，不同类型的肿瘤CTC差别很大，即使同一病人来源的不同CTC细胞表所表达的标志物种类及表达量也有差异；
  2.4CTC可能在循环过程中发生上皮间质转化（EMT）逐渐丧失上皮标志物；
  2.5血液中存在可检测CTC的患者比例随癌症类型的不同而不同。比如结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌大约是50-70%，而非小细胞肺癌则低至30%；
  2.6CTC活力强，有抗脱巢凋亡活性；
  2.7CTC有侵袭和转移潜能。

  图1. CTC的特点

  （二）CTC检测技术
  血液中大部分成分是白细胞和红细胞，CTC所占的比例相对较少。每10mL血液中，含有1亿个白细胞和500亿个左右红细胞，而CTC的数目可能仅有几个到几十个。想要准确地检测CTC细胞数目依赖非常灵敏的检测手段。近年来随着现代医学研究技术的进步和CTC临床应用价值凸显，许多研究机构和研发团队都在推出不同的CTC检测技术。CTC检测技术包括CTC的富集（分离）和CTC的分析鉴定（识别）等5。
  1、CTC富集（分离）
  1.1 免疫亲和法
  建立在免疫亲和原理上的CTC富集方法，利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC。基于免疫亲和的方法也分为很多种5：
  1.1.1免疫磁珠法：以CellSearch?法为代表，在磁珠上包被细胞表面粘附分子EpCAM，来捕获CTC。临床研究证明该方法检测出的CTC数目与肿瘤的预后密切相关。FDA已批准CellSearch?检测的CTC数目用于预测转移性乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌的预后。
  1.1.2微流体法：Nagrath和Toner的团队研发了一种用于捕获CTC的微流体。上面有78，000个微柱与EpCAM的抗体相结合，可直接捕获全血中的CTC。整个微流体共有970 mm2的表面积，在2mL/hour的通量下，CTC捕获效率>60%，特异性在50%左右。在多种转移肿瘤中该方法已被证明有较高的CTC捕获效率。
  1.1.3纳米结构基体：Wang et al等人将EpCAM抗体结合在硅质的纳米基体上，进行CTC捕获。1mL/hour的通量下，可以达到95%以上的捕获效率。一项研究利用该方法对26例前列腺癌进行检测，CTC的检出率为20/26，明显高于CellSearch?系统（8/26）。
  1.1.4微量离心管：由Hughes et al研制，在微量离心管上包被EpCAM及PSMA的抗体，4.8mL/hour的通量下，捕获率可达50%，特异性达66%。用该方法对14例转移性肿瘤患者进行CTC检测，检出率为100%，明显高于CellSearch?系统（9/14）。
  1.1.5体内富集：将结合EpCAM的装置从前臂静脉插入病人体内，并停留30min，从而进行体内CTC富集。临床实验证明这种方法对乳腺癌和肺癌的CTC细胞均有较高的捕获效率。
  1.1.6白细胞去除法：属于阴性富集法。用特异性抗体CD45，CD14等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。该方法比其它富集方法捕获效率更高，但特异性明显低于其它方法。
  利用抗原抗体相互作用原理的CTC富集方法可得到较高的纯度。但捕获效率对细胞表面抗原的表达情况依赖较明显。对于依赖EpCAM的捕获方法，CTC捕获效率与细胞表皮抗原的表达情况密切相关，一些CTC可能由于EMT过程中表皮抗原发生变化而未被捕获。另外EpCAM法仅限于对上皮来源的CTC进行检测。相对于其它方法，免疫亲和法对CTC的富集效率偏低。
  1.2 物理特性富集法
  依据CTC的物理特性，如密度、大小、可变形性及表面电荷等进行富集。
  1.2.1密度梯度离心：非常廉价高效的CTC分离方法，可将CTC与白细胞和红细胞分离。目前市场上有较多的依赖密度梯度离心进行CTC富集的试剂盒，如Ficoll-Paque?solution （PharmaciaFine Chemicals, Uppsala, Sweden） ， OncoQuick?（Grenier BioOne, Frickenhausen, Germany）等。临床实验证明，密度梯度离心富集CTC比CellSearch?系统效率更高。
  1.2.2微孔过滤：依据CTC体积大于血细胞的特性，对CTC进行捕获。该技术已在转移性肝癌，肺癌，前列腺癌，黑色素瘤等肿瘤中被证明有效。捕获效率高于CellSearch?系统。
  1.2.3微流控芯片：最初由Tan和 Lim团队研发，针对CTC的体积和可变形性，CTC的捕获率和特异性均可达到80%以上。在Tan和 Lim研究的基础上，研究者们又发展了不少改进型的微流控芯片。
  1.2.4介电电流：由于CTC与血细胞所携带的电荷不同，在双向电泳的条件下，可将CTC有效捕获（95%）。目前该技术主要对细胞株进行研究，临床标本的研究相对较少。
  物理特性富集法操作简单，成本低廉，不依赖细胞表面抗元的表达，捕获效率较高，但相比其它方法，所富集的CTC纯度较低。

  图2. CTC分离、富集及检测

  2.CTC分析鉴定
  利用免疫亲和或物理特性法可富集到CTC，这只是研究CTC的第一步，还需要结合有效的下游分析方法。一方面由于目前CTC捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC细胞的数目，以减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率。另一方面在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态的变化，CTC所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。常用的CTC分析鉴定技术如免疫荧光、PCR、 FISH及高通量测序等。
  2.1免疫荧光法（IF）
  IF可用于检测CTC表面分子标志物的表达情况。CellSearch?系统应用了免疫荧光对CTC进行鉴定。EpCAM +、CK +、DAPI+、CD45 -的细胞被判定为CTC，而EpCAM +、CK +、DAPI+、CD45 +的细胞不被判定为CTC。在科研方面有非常多的免疫荧光法结合CTC的研究案例。Baccelli等在各自的研究中对富集的CTC进行干细胞相关标志物CD44，CD24, CD133,ALDH1等的检测。Armstrong等在各自的研究中对富集的CTC进行表皮间质细胞相关标志物，TWIST, AKT2, PIK3α，N-cadherin and vimentin等进行检测。Ignatiadis等用IF检测了乳腺癌CTC中HER2的表达。Shaffer 等分别检测了前列腺癌中EGFR和AR基因的表达。
  2.2荧光原位杂交（FISH）
  FISH技术亦可以与CTC非常好的结合，不仅可以检测CTC表面标志物，亦可以检测CTC细胞内部的标志物及核型等。I-FISH CTC检测系统利用白细胞去除法富集CTC后，用FISH法对细胞的核型进行判断，将异倍体阳性，表面EpCAM阳性，和DAPI阳性的细胞定义为CTC。Attard G等6，对89例乳腺癌患者进行研究，在治疗过程中每个月提取一次CTC，并用FISH技术检测TMPRSS2-ERG融合基因，AR和PTEN拷贝数变化，该研究发现CTC表面标志物与组织活检有高度的一致性，并最终分析出在前列腺癌治疗过程中，上述基因的动态变化。另一个典型的例子是Pailler E等7发表在J Clin Oncol上的一项研究。研究对象是18例组织检测ALK融合基因阳性和14例组织检测ALK融合基因阴性的肺癌患者。结果表明组织检测ALK融合基因阳性患者体内可检测到ALK融合基因阳性的CTC，这些ALK融合基因阳性的CTC在融合位点方面有很强的异质性，各种类型的CTC所占比例在crizotinib治疗过程中动态变化。
  2.3基于PCR的检测方法
  CTC富集结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。Sieuwerts等8对50例转移性乳腺癌患者进行研究，术前采集CTC，其中CTC数目的大于5的患者为32例。接下来用RT-PCR法检测55个mRNA和10个miRNA，依据这些基因的表达情况，将转移性乳腺癌患者分成四类，每类患者的恶性程度和预后是不同的。这种分类方法比依赖HER2和ER进行分类能更好地指导临床。Chang K等对75例前列腺癌患者进行研究，统计外周血中CTC的数目，并检测CTC所含的干细胞相关基因（ABCG2，PROM1，PSCA）和EMT相关基因（TWIST1和vimentin）的表达情况，经统计分析发现，CTC中干细胞相关基因的表达情况可作为前列腺癌的预后指标。位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。例如，MaheswaranS等9对接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的非小细胞肺癌患者进行CTC检测，在统计CTC的数目的同时，对CTC携带的EGFR激活突变进行检测，统计结果表明，携带T790M突变CTC的患者表现出明显的TKI耐药，且无进展生存期明显低于不携带T790M突变CTC的患者（7.7 months vs 16.5months, p<0.001）。
  2.4高通量单细胞测序
  随着新一代测序技术的发展，对单个CTC细胞进行测序具有了可行性。CTC单细胞测序首先依赖于单细胞扩增技术。比较有代表性的是哈佛大学谢晓亮团队研发的多重退火和成环循环扩增技术（MALBAC）。该技术能从一个细胞的基因组中，分离出来自单细胞的DNA，然后添加称作引物的短DNA分子。这些引物可与DNA的随意部分互补，从而使得它们能够附着到DNA链上，充当DNA复制起点。MALBAC可以有效地降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异10。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。另一种常用的单细胞扩增技术被称作多重置换扩增（MDA）。该方法随机设计引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用特定的聚合酶，这种聚合酶能够转换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构，扩增出大段DNA。单细胞扩增技术保证了足够量的DNA进行高通量的检测。目前不少课题组都发表了CTC单细胞高通量测序的相关文章，证明了CTC单细胞测序方法的可行性和有效性。例如HeitzerE等11对来自6例结直肠癌的37个CTC进行单细胞测序，Ni X等12对来自11例肺癌病人的24个CTC进行全基因组测序。
  （三） CTC研究现状
  CTCs检测是“液态活检”的重要工具，是目前转化医学研究的热点。大量的临床研究结果提示，CTC具有重要的临床应用潜能。在许多恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、大肠癌等中均能发现CTCs（详见延伸阅读部分）。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，CTC检测具有明显优势：（1）CTCs比传统方法更敏感地发现肿瘤的变化，并对肿瘤患者的预后、复发和转移进行监控；（2）CTCs检测是一种非侵入性的诊断工具，它的分离富集只需要抽取患者少量外周血，对患者无创，也无副作用，同一患者能够反复多次采集。目前有关CTC的研究主要集中在早期筛查、辅助肿瘤分期、预后评估、个体化治疗策略制定，疗效及耐药监测、复发和转移预警等方面。
  1.肿瘤早期筛查
  肿瘤的预后与发现时机密切相关。80%的肿瘤若能早期发现都可以治愈。影像学是目前临床上最常用的肿瘤筛查手段，但影像学只能检测3mm以上的肿瘤，对更微小的病灶不能分辨，因此难以做到肿瘤的早期诊断。血清标志物也用于早期诊断，但目前可用于临床的血清标志物种类有限，灵敏度和特异性均不理想。在肿瘤早期诊断方面，CTC越来越引人关注。2007年ASCO将CTCs纳入了肿瘤标志物。
  Tanaka等13将125例肺癌患者和25例肺部良性患者的CTC阳性率进行比较，发现肺癌患者阳性率明显高于良性肿瘤患者阳性率（30.6%vs 12.0%），说明CTC检测对肺癌诊断具有指导意义，有望成为高危患者早期筛查协助诊治的重要手段。2014年法国巴斯德医院Ilie等人的研究则证实CTCs检测可用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者肺癌早期筛查。他们在3%（5/168）的COPD患者外周血中检测到CTCs，而这些CTCs阳性的患者在随后的1～4年内的LDCT检查中发现了肺部结节。
  2.辅助肿瘤的分期分级
  血液系统是肿瘤转移的重要途径，是否发生远处转移是判断临床分期的标准之一。如果将外周血CTC计数作为临床分期的一个参考条件，可增进对肿瘤分期的理解，有利于医生制定肿瘤治疗方案。
  如Sastre等14对97例结直肠癌患者和30例健康对照者的CTC检测分析发现，将CTCs≥2个/7.5 mL外周血定义为阳性，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者阳性率分别为20.7%、24.1%、 60.7%（P = 0.005），表明CTCs检测有助于结直肠癌的辅助诊断和临床分期，可作为TNM传统分期系统的有效补充，从而指导下一步的治疗。TodenhoferT等对83例膀胱癌患者和29例健康对照者的检测分析发现，CTC在I期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者阳性率依次升高，并且CTC的EMT相关标志物和干细胞相关标志物的表达也在不同分期的膀胱癌患者中有显着差别。由此可见，CTC的数目及表面标志物表达与膀胱癌患者的分级显着相关。KolostovaK等对118例卵巢癌患者进行CTC检测分析发现，CTC数目与卵巢癌的恶性程度有明显的相关性，与CA125的表达丰度也密切相关。
  3.预后评估
  目前，多种肿瘤中已发现CTC数目与预后密切相关。FDA批准CellSearch?CTC检测系统用于转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的预后评估、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）预测的产品。
  2004年，Cristofanilli等15在一个多中心、前瞻性、双盲临床试验中，用CellSearch?系统检测177 例转移性乳腺癌患者7.5 mL 外周血中CTCs 的数量，发现治疗前外周血中CTCs ≥5 个的患者治疗后的中位PFS和OS均短于CTCs＜5个的患者，并且治疗一周后CTCs数目增高患者的PFS和OS也显着短于治疗后CTC数目没有升高的患者。这项研究发表在NEJM上，也正是基于此项研究，美国FDA批准CTC用于转移性乳腺癌的预后评估。我国学者江泽飞教授等人针对中国转移性乳腺癌（MBC）患者进行的一项多中心研究首次发现，CTCs计数可为中国MBC患者提供较为确切的预后信息，并可作为PFS与OS相关的独立因素。Cohen等16进行的一项前瞻性研究中，对430例转移性结直肠患者分别在治疗前后进行CTCs计数，发现以3个CTCs/7.5 mL外周血为阈值，CTCs≥3的患者组中位无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）均短于CTCs＜3的患者组。基于此项研究，FDA批准CTCs计数为转移性结直肠癌的预后预测因子。此外，在非小细胞肺癌，肝细胞癌，胰腺癌，内分泌瘤等肿瘤中，均观察到，CTC数目与PFS或OS密切相关。CTC数目越多，患者的预后越差。
  4.个体化治疗策略制定
  不同的个体由于致病性突变不同，对同一治疗方案的反应存在重大的差别，因此对患者进行个体化治疗意义重大。传统上对于肿瘤致病性突变是利用肿瘤组织活检或手术取得的组织标本进行检测。但上述方法只能在特定时间点检测，而且可能只对肿瘤组织的局部区域进行检测，不能反应肿瘤的动态变化，也很难反应肿瘤组织中最具代表性的驱动突变。近年来，越来越多的证据证明，CTC检测是对肿瘤进行个体化治疗的有效手段。
  Yen等17对76例转移性结直肠癌患者进行研究，同时检测CTC数目及CTC细胞KRAS的突变情况。经统计，携带KRAS野生型CTC的患者在接受西妥昔单抗和化疗联合治疗时比携带KRAS突变型CTC患者有更长的无进展生存期和总生存期。尽管CTC基因检测结果与组织检测结果有较高的一致性，但也有存在差异的情况。研究证明，当CTC基因检测结果与组织检测结果不符时，CTC对个体化治疗的指导意义更大。以乳腺癌为例，Pestrin等18对66例晚期乳腺癌患者进行CTC检测。在CTC阳性的患者中，29%的HER2阴性乳腺癌患者体内检测到了HER2阳性的CTC，而37%的HER2阳性的乳腺癌患者体内检测到了HER2阴性的CTC。对组织检测HER2阴性，CTC检测HER2阳性的乳腺癌患者进行靶向治疗，患者均从治疗中获益。
  5.疗效及耐药监控
  对于恶性肿瘤患者，如何判断治疗（特别是化疗）的有效性是临床的热点问题之一。影像学检查只能针对化疗无效且化疗期间出现复发和转移的患者给予判断，对于病情是否出现好转则大多无法在化疗期间判断。研究表明患者在治疗前后CTCs的数量的变化及CTC分子标志物的变化与肿瘤的疗效评价体系有很好的对应关系，CTC是对肿瘤疗效监控的有利工具。Pachmann等对30例均可检测到CTCs的患者进行CTCs计数（每3个化疗周期1次），结果发现CTCs计数减少与瘤体减小呈线性相关（R2=0.97），提示CTCs计数可作为评估新辅助化疗疗效的早期指标。Okegawa等19对80例转移性前列腺癌患者开始内分泌治疗前进行基线CTC计数，其中44例CTC计数≥5的患者内分泌治疗中位有效期为17个月，而CTC计数＜5的患者内分泌治疗中位有效期为32个月或以上，差异有显着统计学意义（P=0.007），表明CTC计数是内分泌治疗的敏感预测因子，治疗使CTC计数降低至＜5的患者从治疗中获益较大。另外Darshan等20研究发现CRPC患者外周血CTC中AR的亚细胞水平定位可以预测患者对多西他赛化疗的反应。他们在CRPC患者接受多西他赛化疗期间，利用CellSearch?检测系统分离其外周血中CTC，采用免疫荧光技术标记AR后在共聚焦显微镜下对AR进行亚细胞水平的定位，发现CRPC患者对多西他赛化疗的反应与AR的亚细胞水平定位有关，CTC胞质及胞核中均有AR分布的患者可能对多西他赛化疗反应较差，应更换其他治疗方案。
  肿瘤患者在经过一段时间的化疗治疗后，相当比例的病人会出现化疗耐药，过去只能在化疗的随诊时才能回顾性评价。近年来，越来越多的研究表明，患者外周血内CTC数目和基因表达是随着患者治疗过程而动态变化的，通过监测血液中CTC数目变化及相关标志物的变化，来实时监测肿瘤药物耐药是一种非常有效的方法。KuhlmannJD等对接受铂类治疗的143例卵巢癌患者进行研究，用CellSearch?法进行CTC捕获并结合Realtime，检测CTC中ERCC1基因的表达，最终发现ERCC1（+）CTC是铂类耐药的预测因子（P = 0.010）。Gradilone A等对42例接受化疗的转移性乳腺癌进行研究，在化疗的不同阶段，检测CTC的数目及MRPs，ALDH1，HER2/ neu，ERα等基因的表达情况，发现CTC 中MRPs 基因高水平表达的患者接受化疗的效果较差。Li Y等利用I-FISH法对晚期胃癌患者的CTC进行检测，发现有不同8号染色体倍性的CTCs与紫杉醇或者是铂类化疗的敏感性或者耐药性相关。
  6.肿瘤转移复发的早期预警
  肿瘤转移复发是肿瘤致死的主要原因，对于多数肿瘤，若能早期检测到转移复发，患者还有很大的治疗机会。但传统影像学检测不能对肿瘤转移和复发早期预警。
  MD Anderson中心的研究者们对63例III期炎性乳癌患者进行了研究，在系统治疗后，每隔一定时间段检测CTC，平均随访时间为38个月。多元变量分析提示，在随访期间检测到CTC的患者比CTC检测结果阴性的患者有更早复发的风险（HR=4.22，p=0.005）21。CTC既能单独存在，亦可成簇存在，与单个CTC相比，CTC簇有更高的转移潜能。哈佛医学院的科学家们对乳腺癌患者体内分离的单个CTC和CTC簇进行RNA测序。发现在CTC簇中，细胞粘附蛋白珠斑蛋白的表达水平明显高于单个CTC细胞。动物模型实验证明消减粘附蛋白能够抑制转移灶的形成。科学家们推测，单个CTC细胞领先珠斑蛋白相互粘附，形成CTC簇，增加了转移潜能22。
  （四）CTC研究的最新进展
  CTC应用于肿瘤发生发展机制的研究有非常明显的优势。一方面，CTC是由肿瘤组织脱落，进入外周循环系统的有活性的肿瘤细胞。CTC所携带的分子标志与肿瘤组织活检结果有高度的一致性，并且能反应在某一阶段起主导作用的分子生物学事件；另一方面，传统的研究方式，受标本采集所限，只能对肿瘤发展过程的少数几个时间点进行研究。而CTC检测作为液态活检，可以反复，多次，无创地进行标本采集，能够完全地对肿瘤发生发展的全程进行研究。随着CTC相关技术的发展，CTC日益成为一种研究肿瘤发生发展机制的有效工具。研究CTC在肿瘤不同阶段数目和分子标志物的变化是研究肿瘤发生发展动态过程的有效策略。
  1.利用CTC检测研究肿瘤的异质性和克隆演化
  肿瘤组织有明显的异质性，肿瘤组织不同细胞之前有不同的基因组背景，对不同阶段CTC分子标志物进行检测能够研究肿瘤的异质性及克隆演化规律。2013年Proc Natl Acad SciU S A杂志上发表了一项针对肺癌CTC测序的研究结果。研究者从11例肺腺癌患者外周血中分离了24个个体CTC，用MALBAC进行基因组扩增，之后进行全基因组测序，并分析了拷贝数变异和单核苷酸变异。结果表明，不同患者之间CTC的基因组特征差别很大，从同一患者体内分离出的不同CTC有一定差别，但与原发灶和转移灶序列之间有进化上的关系12。Jiang R等23对1例转移性前列腺癌患者不同时期外周血CTC、原发灶、转移灶进行全基因组测序。并比较了不同标本中的驱动性突变的分布，证明不同CTC之间，CTC与原发灶或转移灶之间既有共性又有特性，存在进化关系。

  图3. CTC全基因组测序

  2. 利用CTC检测研究肿瘤的转移机制
  肿瘤的转移机制长期以来是肿瘤研究的难点，而CTC检测结合其它分子标志物检测技术能够很好地反应肿瘤从原发灶到转移灶变化的动态过程。
  在Yu M等24的研究中，对17例乳腺病人在不同时间点进行CTC采集，分离成单细胞，一部分进行CTC单细胞测序，一部分用Realtime PCR检测表皮和间质细胞标志物，并与临床数据进行关联分析，最终发现在发生转移的乳腺癌患者中，上皮细胞的表面标志物逐渐减少，而间叶细胞表面标志物逐渐增加，转移的乳腺癌患者的CTC细胞间叶细胞标志物的表达丰度明显高于非转移的乳腺癌患者。一系列结果证实了乳腺癌转移过程中EMT假说，相关研究结果发表在2013年Science杂志上。Baccelli L等25将有干性（EpCAM+，CD44+，CD47+，MET+）的人原发性乳腺癌的CTC进行分离并注入裸鼠体内，最终植入干性CTC的裸鼠体内产生了骨，肺，肝等部位的转移灶。接下来，作者在多例乳腺癌患者中检测了CTC数目及CTC中干性标志物的表达情况，结果提示，干性标志物表达阳性的CTC越多，形成转移灶的数目越多，且患者的生存期越短（图3）。

  图4. CTC与乳腺癌转移

  3. CTC细胞体外培养及个体化治疗相关研究
  CTC作为一种有活性的细胞，可以从体内富集分离，并在体外扩增培养。很多实验室都报道了体外成功进行CTC培养的案例。如Cayrefourcq 等成功地建立了结肠癌CTC细胞系，Gao等建立了前列腺癌的CTC细胞系，Zhang等建立了乳腺癌CTC细胞系。2014年，《Science》上的发表了一篇CTC相关的研究成果。研究者们从6例ER阳性的乳腺癌患者中分离出CTC细胞，进行体外扩增培养。成功培养的5个细胞系中有3个可以使裸鼠成瘤。

  图5. CTC细胞体外培养

  对这些细胞系进行基因组测序发现了FGFR2，PIK3CA， ESR1等基因的驱动变异。随后的药敏实验发现CTC药物敏感性测量结果与临床病史一致，包括紫杉醇和卡培他滨的敏感性，氟维司群和阿霉素的耐药。CTC培养可以帮助恶性肿瘤患者在整个疾病过程中接受最好的治疗。这篇文章充分说明了CTC培养的可行性和临床意义26。
  （五）CTC研究策略简介：
  CTC是目前液态活检最重要的技术之一，研究CTC既能够提高肿瘤的诊疗水平，又有助于反应肿瘤发生发展机制。下图概况了CTC的研究策略。在肿瘤患者治疗前及治疗的不同时间点，采集外周血，检测CTC数目，CTC基因突变或分子标志物表达，最终与随访数据综合统计分析。

  图6. CTC研究策略

  （六）总结与展望
  CTC作为一种重要的液态活检技术显现出非常大的应用潜能，已经成为转化医学领域的亮点。目前有关CTC的研究论文已经接近两万篇。随着CTC检测技术的进一步完善，及CTC检测成本的逐渐下降，CTC将会有越来越大的用武之地。
  临床上，尽管目前FDA仅批准CTC对乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌预后评估，越来越多的临床研究证明CTC是有效肿瘤早筛、辅助诊断、预后评估、实时监控和复发预警等方面的标志物。随着CTC检测技术的成熟，及CTC相关临床数据的积累，CTC检测将会越来越多地写进临床指南（各种肿瘤与CTC研究详见延伸阅读部分）。
  科研上，近年来单细胞测序、CTC培养等技术突飞猛进，CTC日益成为研究肿瘤发生发展机制的有效工具。尤其在肿瘤转移方面，依赖CTC技术，会有越来越多肿瘤转移的机制被揭开。
  三、肿瘤外泌体研究进展及技术平台简介（详见肿瘤外泌体研究专辑）
  （一）外泌体（Exosome）简介
  Exosome是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm的膜性囊泡。Exosome的来源广泛，除了网织红细胞以外，T细胞、B细胞、血小板、树突状细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等，被分泌出的Exosome会进入各种体液如羊水，腹水，鼻灌洗液，唾液，血清，血浆，乳汁，尿液，脑脊髓液等中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用1,2。
  Exosome内含物的很大部分是蛋白质，如：Annexins、CD9、CD63、CD81、MHC-I和Tsg101等；肿瘤细胞产生的Exosome中还可以检测到过度表达的蛋白质标志物，如FasL、TRAIL和TGF-β等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白，这使得Exosome在肿瘤及相关疾病的诊断中具有重要的潜在应用价值。除蛋白质外，Exosome中还含有大量的mRNA、miRNA、lncRNA和cirRNA等3,4。

  图1. Exosome的组成（Zhang et al. Journal of Hematology &Oncology, 2015, 8:83）

  随着蛋白质组学研究和基因测序技术的快速发展，已经发展出一个Exosome数据库（http://microvesicles.org; http://exocarta.org）。据检测结果，细胞外囊泡可以携带92,897种蛋白质，584种脂类分子，4,934 种miRNAs及27,642种mRNAs。肿瘤患者和自身免疫性疾病患者Exosome的含量比正常人要高，这表明其在各种疾病中的重要作用，目前，已有越来越多的学者开始关注Exosome在肿瘤发生和发展中的作用及其机制。
  （二）Exosome研究意义
  1.Exosome与肿瘤的早期诊断
  肿瘤在生长过程中会不断地将Exosome释放到周围环境中去，同时，Exosome能在4℃保存96h，或是在-70℃下保存更长时间5，可以从患者血清或尿液等体液中分离Exosome用于早期临床诊断。
  1.1可作为胰腺癌诊断的生物标志物
  2015年，美国德克萨斯大学研究者Sonia A. Melo等人在Nature发文报道了他们基于Exosome标志物所建立的主要依靠检测一种锚定在血液中Exosome质膜上的磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）来实现非侵入性的胰腺癌诊断方法，这种方法可以非常精确地从良性胰腺疾病中诊断出早期癌变6。

  图2.GPC1+ Exosome与胰腺癌早期诊断

  1.2可作为黑色素瘤诊断和预后的生物标志物
  Exosome中存在黑色素瘤标志物包括MIA、S100B和酪氨酸酶相关蛋白2（Tyrp2）等的潜在临床应用价值7。黑色素瘤患者胞外体中MIA和S100B浓度显着高于健康对照人群和非黑色素瘤患者。在黑色素瘤患者胞外体中检测到了MIA和S100B，对它们的量化具有诊断和预后的作用。
  2. Exosome与肿瘤转移
  2.1Exosome连接“种子”和“土壤”
  美国M.D. Anderson 肿瘤中心的Dihua Yu等发现正常表达PTEN的肿瘤细胞在脑部定植时，其PTEN的表达会降低，当从脑部重新分离出来后，其PTEN表达水平会恢复。肿瘤细胞转移到脑部后可以被神经胶质细胞分泌的Exosome所改造，其Exosome内部携带大量的miRNA-19a可以靶向肿瘤细胞内的PTEN mRNA从而影响肿瘤细胞内PTEN的蛋白水平，进而影响CCL2和NF-kB等通路促进肿瘤细胞的增殖，提升肿瘤细胞的抗凋亡能力8。这一发现，印证了百年前Paget的假说，脑部特定的微环境正是适宜肿瘤“种子”生长的“土壤”。

  图3. Exosome与肿瘤细胞脑转移

  2.2决定肿瘤转移的器官特异性
  2015年《自然》（Nature）杂志上的一篇论文是第一项关于肿瘤分泌的Exosome在器官特异性转移中所起的作用。蛋白质组学研究分析了肿瘤Exosome中的近1000种蛋白，发现Exosome中整合素（integrin）α6β4和α6β1在肺转移中起关键作用；而Exosome中 integrin αvβ5 在肝转移中起关键作用。如果下调integrins α6β4和αvβ5，能分别阻止肺和肝转移9。

  图4. Exosome与肿瘤器官特异性转移

  2.3促进肿瘤侵袭和扩散
  Exosome促进肿瘤侵袭和扩散主要是通过EMT--上皮间质化。Exosome在肿瘤的快速转移也表现于其参与血管的形成。Exosome蛋白质分析可以发现IL-8和VEGF（可参与新血管形成）表达量增多10。
  （二）肿瘤液态活检的最新技术---Exosome检测平台
  1、目前临床检测Exosome方法
  1.1超速离心法：是最常用的Exosome纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。
  1.2密度梯度离心：通过密度梯度离心，样品中的Exosome将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。
  1.3超滤离心：利用不同截留相对分子质量（MWCO）的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得Exosome。
  1.4磁珠免疫法：Exosome表面有其特异性标记物（如CD63、CD9），用包被抗标记物抗体的磁珠与Exosome孵育，即可将Exosome吸附并分离出来。
  1.5 PEG-base沉淀法：聚乙二醇（PEG）可与疏水性分子结合共沉淀，被用来沉淀Exosome。
  1.6试剂盒提取：近年来已出现各种商业化的Exosome提取试剂盒，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。
  6.1 ExosomeDiagnostics公司推出全球首个基于ExosomeRNA的液体活检产品：ExoDx? Lung（ALK）。 ExoDx Lung（ALK）已在Exosome Diagnostics公司的CLIA认证实验室得到验证，是一种基于血浆Exosome的诊断产品，可灵敏、准确、实时检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EML4-ALK突变。
  6.2用于Exosome分析的集成磁电化学感受器（IMEX）将两个正交的磁性选择系统和电化学检测系统结合。使用小磁珠捕获Exosome，捕获的Exosome通过电化学传感器检测。
  6.3肿瘤Exosome的新一代测序分析：MD安德森癌症中心的研究人员从胰胆管癌患者的体液中分离出Exosome。对exoDNA、exoRNA进行全基因组、外显子组和转录组测序分析，表明Exosome中含有肿瘤细胞来源的DNA片段。
  （三）Exosome RNA研究策略简介

  图5. Exosome研究策略（转化医学网360zhyx.com）