比iPS安全性更高——细胞重编程

图中绿色的心肌细胞是天然细胞。橙色的是成纤维细胞。成纤维细胞可以直接重编程，转化成心肌细胞。

直接将成熟细胞转化为另一种类型细胞的方法能大幅推动再生医学的发展。

当一个细胞分化成皮肤细胞后，它到死都只会是个皮肤细胞——至少科学家们以前是这么以为的。过去10年，科学家们已经发现，细胞身份并不是固定不变的，而是可以通过激活特定程序进行改写的。如今，再生医学领域面临着一个问题：细胞重编程是先将成熟细胞转化成干细胞，再转化成特定类型细胞，还是直接转化成其它类型的细胞？

旧理论认为，皮肤、肌肉或其它成熟细胞都是“终末分化”细胞，无法被诱导成其它细胞。而10年前，日本京都大学（Kyoto University）的细胞生物学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）发现了诱导性多潜能干细胞（iPS）后，这一理论发生了动摇。iPS细胞和胚胎干细胞一样，可发育成任何细胞类型——即具有细胞多潜能性。但相比于胚胎干细胞，iPS细胞没有伦理问题，而且可以大量增殖。

Yamanaka因为iPS这一发现获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖——几年后，研究者们发现了改变细胞类型的捷径。这种“直接重编程”是把一种成熟细胞经诱导，直接成为另一种类型的细胞，不经过转化为iPS这一中间阶段。研究人员已成功将皮肤细胞转化为心脏细胞或神经元细胞，将胃细胞转化为分泌胰岛素的β细胞。 德国美因兹大学（Johannes Gutenberg University）Benedikt Berninger 高度评价了这些研究成果，他表示，亲眼看到细胞类型转化非常神奇。

直接重编程的研究相对初步，但它激发了学界对再生医学的兴趣。直接重编程细胞的安全性可能比经iPS转化的细胞更高，因为iPS细胞和肿瘤细胞一样，具有强大的增殖能力，具有潜在的致癌性。

基于iPS细胞的临床治疗需要十分小心，需要谨防移植的成熟细胞中没有混入多能性细胞。瑞典隆德大学（Lund University）的神经生物学家 Malin Parmar 表示，一旦混入多潜能性细胞，它们在体内会恶性增殖。因此，如果细胞重编程可以跳过iPS阶段，对临床来讲，会更加快速安全。Parmar现在致力于研究利用直接重编程，逆转帕金森病人大脑中的神经元丢失。

改写遗传程序

改写细胞身份，首先需要理解这些身份的确立机制。身体里的每个细胞都可以追溯到单一的起源——受精卵。在胚胎细胞分裂和成熟过程中，各个细胞的命运由特定基因的开启或关闭决定。转录因子结合到基因组中的特定DNA序列上，激活或抑制附近的特定基因，调节该基因的转录。一种决定细胞命运的关键转录因子为主调节因子（master regulator），这是因为它能调节一连串基因的活性。
哈佛大学干细胞研究所（Harvard Stem Cell Institute）的细胞生物学家Qiao Zhou指出，这些主调节因子确定了细胞分化的类型。一种前体细胞可能发育成A、B和C细胞，但如果你迫使它表达某种主调节因子，那么它一定会分化成A细胞。

事实上，早在1987年，就有研究证实主调节因子可用于直接重编程。那时，弗雷德-哈金森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）的Harold Weintraub和Andrew Lassar 等人发现，诱导成纤维细胞表达某一段DNA，可以使其发育成肌肉细胞。这段DNA负责编码的是转录因子MyoD。格拉德斯通心血管病研究所（Gladstone Institute of Cardiovascular Disease）的心脏发育研究员Deepak Srivastava指出，这在当时引起了非常大的轰动。很多研究者因此认为，大多数类型的细胞中存在一种类似的转录因子，能够调控细胞命运。

但事情远比想象的复杂。寻找单个控制细胞命运的主调节因子的努力一直以失败告终—— 直到Yamanaka证实，多个因子决定细胞命运。此后，研究人员尝试了不同的转录因子组合时，成果迭出。
2008年，Zhou是哈佛大学的科学家Douglas Melton带领的团队中的一员。该团队成功地将一种类型的胰腺细胞转变成另一种，得到了很多患者需要的分泌胰岛素的β细胞。Zhou表示，这项研究的结论是，至少需要3个及以上的转录因子才能决定细胞命运。2010年，斯坦福大学（Stanford University）的干细胞科学家Marius Wernig团队使用3个基因成功地将成纤维细胞转化为神经元细胞。这项工作的后续工作得到了不同类型的神经元，这些神经元可以释放或应答不同的神经递质。

大部分直接重编程研究都在体外进行。对于再生医学领域来说，体内试验更具吸引力。例如，把器官中相对丰富的细胞类型转化成其它类型的成熟细胞，就极具临床意义。迄今为止，只有少数动物试验获得成功。例如，Parmar的团队发现，通过使用病毒载体携带重编程因子的基因进入小鼠大脑，能成功第将神经胶质细胞转化为功能性的神经元。Srivastava成功将小鼠心脏内的成纤维细胞转化为跳动的心肌细胞，这种策略可能用到心肌损伤的修复中。Srivastava表示，体内细胞非常丰富，你可以利用这些细胞，实现再生医学。但目前尚没有以人为实验对象的直接重编程研究。

身份危机

现在，大多数的研究重点是确保重编程过程的成功。研究者们不仅需要找出能决定细胞命运的调节因子组合，还需要找到最简单的组合。这是因为，最可靠的迫使细胞表达一种调节因子的方法是将基因递送到细胞中。递送基因的数目越多，递送的难度越大。但寻找最简单的调节因子组合是个苦差事：候选组合非常多，需要逐一排查，耗时耗力。例如，Parmar团队在研究产生多巴胺的神经元的命运决定因子组合时，选择了12种因子作为候选，最后他们成功确定了2种基因。

一些研究人员已经开始设计专用于直接重编程的软件，该软件整合了主调节因子的相关信息。一个囊括三大洲人才的开发团队，开发了一种名为Mogrify的实验规划工具。该软件整合了各种细胞类型的基因表达数据和不同主调节因子控制的基因网络。基于这些信息，Mogrify可以预测可能的组合以供选择。同时，Mogrify可会根据其它类型细胞最佳的组合，鉴别出对另一种细胞最有效的组合。

但是， 有效的主调节基因组合并不能保证完全的重编程：主调节因子可能成功开启了细胞的一条发育道路，但可能让细胞停留在未成熟的前体状态。接下来的任务是鉴定出其它的、确保该细胞能完成这一发育过程的基因。

北京大学的干细胞生物学家邓宏魁（Hongkui Deng）多年来一直致力于解决这个问题。最开始，他通过诱导主调节基因表达，将皮肤细胞直接转化为肝细胞。然后，他开始进行第二轮筛选，确定保证重编程完成的基因。他将这些确保重编程完成的因子称为成熟因子 ——那些在启动细胞命运通路时不起作用，但在获得功能性上起重要作用的基因。

其他研究人员发现，一些化学物在重编程的通路中起重要作用，可以以此来提高重编程成功率。甚至有时候，化学物单独就能促进重编程（见文后：化学物促进细胞重编程）。

即使有合适的基因和化学物，证明重编程是否真的发生仍然非常困难。通过显微镜观察能看出细胞是否发生转化——例如，扁平、星形的成纤维细胞长出常常的轴突状突出就意味着它开始转化了。但形态变化是不够的，还需进一步的细胞内部分析。简单地说，如何确保皮肤细胞重编程之后，会变成真正的神经元，而非神经元形状的其它细胞？

挖掘主调节基因的下游活动可以深入认识重编程的机制。如果引入的主调节因子能够发挥作用，它们会引起细胞核内全基因组表达模式的变化，并且这些模式应当与组织中成熟细胞的表达模式相匹配。有几种方法可以研究细胞的全基因表达——例如，检测细胞内所有的RNA分子。波士顿大学（Boston University）和哈佛大学（Harvard University）的研究人员在CellNet工具中整合这类信息，然后利用这类信息评估重编程细胞中基因活力是否能与目标细胞相匹配。

Malin Parmar的实验室，研究者们在研究重编程的神经元。

尽管如此，最重要的问题是：重编程细胞是否能取代功能自然分化的细胞。德克萨斯大学西南医学中心（University of Texas Southwestern Medical Center）的神经生物学家Chun-Li Zhang指出，如果细胞长得像神经元，且和神经元细胞有着相同的基因表达，它们也不一定是神经元。具有说服力的证据需要系统的评估，比如，检测形成的神经元类似物是否能放电，是否能激活与其形成突触的其它神经元。Zhou还表示，没有一种单一实验能确认细胞身份。他的小组试图重编程肝脏细胞，以获取胰岛β细胞，但结果只得到了功能异常的中间产物。 他认为，这些中间产物合成的胰岛素太多，以至于实验动物死于低血糖。这是因为这些细胞无法像正常胰腺细胞一样检测血糖水平，并对其做出响应。

这些测试证实了一个发现：靶器官内促进细胞重编程通常要比体外培养的效果好。 Srivastava表示，体外环境中，只有少数细胞经过重编程，会形成心肌细胞。但在体内环境中，绝大多数细胞转化成了可以跳动的细胞，并且与周围细胞产生了电生理联系。这可能是由于自然环境中，周围细胞产生的化学信号促进了细胞转化。也有可能是因为器官内的3维环境更有效。不管什么原因，它预示着直接重编程可能非常适合应用于临床。

临床之路

但要想在人体上测试这些方法，研究者们需要克服一系列的问题。有证据显示，一般情况下，人的细胞比小鼠细胞更难重编程：重编程时间更长，而且往往需要额外的转录因子。

基因递送也具有严峻的挑战，尤其是将基因递送到大脑等器官。在某些情况下，优先感染特定细胞类型的病毒可有助于引导重编程因子进入特定的病灶或损伤位点，但非特异性递送仍会造成健康隐患。

另外一个问题是“借东墙补西墙”。例如，把大脑中的胶质细胞转化成神经元，那么胶质细胞数量就会减少，这也会带来风险。 Berninger提到，这些细胞可不是起装饰作用的，它们本身有重要作用。如果我们把它们转化了，那又要用什么细胞来弥补它们的功能呢？一种可能性是使重编程细胞进入一种增殖性的、非致瘤性的神经祖细胞。通过这样的方式，少数胶质细胞就能产生大量的神经元细胞。

心脏治疗很可能最接近于临床应用。Srivastava团队已经开始研究将猪心脏中的成纤维细胞转变成心肌细胞。 他指出，他们已经初步证明：即使在猪心脏这么大的脏器中，他们也能成功实现细胞重编程。该小组目前正在开展安全性研究，完善基因传递方法，以求通过人体试验监管机构的批准。重要的是，心脏成纤维细胞能够自我补充，因此“借东墙补西墙”的问题没有那么严重。

Zhou的团队在尝试将胃肠道细胞转化为β细胞，并且也在努力开发临床应用。肠道细胞很容易通过活检获得，经过体外培养和重编程后，理论上这些细胞能被移植到糖尿病患者的胰腺中。

尽管直接重编程已开始获得产业界的关注，但生物技术和制药公司仍没做好准备大量投入。虽然iPS细胞和胚胎干细胞的研究相对成熟，但直接重编程可能后来者居上。 Zhou表示，虽然直接重编程领域人力和资源都相对少，但它在茁壮成长，未来难以限量。

化学物促进细胞重编程

转录因子是重编程基因活性的天然选择，但首先需要将这些基因递送到目标细胞中。这一过程非常费力，而且带来了临床应用上的一些安全顾虑。

化学生物学家Sheng Ding已经找到一种替代方法：使用化学物组合诱导直接重新编程。他就职于格拉德斯通心血管疾病研究所（Gladstone Institute of Cardiovascular Research），过去10年都致力于建立调控基因表达的化合物库。使用化合物A83-01和LDN193189，Ding成功关闭了特定细胞通路，在未使用转录因子的情况下，开启了细胞重编程。

他认为，这种化合物法更天然，因为是通过激发细胞内部机制，诱发重编程的。 这是一种渐进的重编程。

在最近的两个实验中，Ding等人通过使用9种化合物的组合，成功将成纤维细胞转化成神经干细胞和心肌细胞。尽管这些结果非常令人深刻，Ding的合作者——心脏研究者Deepak Srivastava指出，这种方式产生的心肌细胞相比于转录因子诱导产生的心肌细胞更不成熟。

但他同意，化合物法更能精确控制。Ding方法的支持者也认为这种方法能够避免基因治疗的一些并发症。只有很小一部分实验室尝试这种方法，但越来越多的人开始支持这种方法，其中包括北京大学的邓宏魁。Srivastava认为，未来化合物重编程法会成为大势所趋。（转化医学网360zhyx.com）