CAR-NK：你所不知道的免疫疗法

  说到免疫疗法，首先出现在你脑海中的肯定是CAR-T、TCR-T，这两种免疫疗法各大媒体都已经做过详细的介绍。所以，今天我们聊聊不被大家所熟知的免疫疗法：CAR-NK。

  CAR-T的局限性和缺陷

  嵌合抗原受体（chimericantigenrecep-tor，CAR）修饰的T细胞（CAR-T）在白血病研究中取得了重大突破，为血液肿瘤患者带来了新的希望。但是伴随着对血液肿瘤显著疗效的同时，CAR-T治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子风暴等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。

  1、细胞因子风暴

  这是CAR-T技术在临床应用中一个最主要的不良反应，由于T细胞的大量增值引起的细胞因子释放，引起机体出现发热或发烧，肌痛，低血压，呼吸衰竭等症状。而针对CAR-T细胞回输引起的细胞因子风暴，临床上利用IL-6受体拮抗药物tocilizumab能够缓解。同时有研究小组也观察到细胞因子风暴也与疾病进展程度或者肿瘤负荷有相关性，在高疾病负荷的患者体内，有较高的细胞因子释放。临床表现就是病人超高烧不退，如果不控制好，很有可能就救不回来了。这就是为什么说CAR-T的最后一步是严密监护病人，这其实非常关键。

  2、靶向细胞毒性

  由于CAR-T抗原的靶向性非常强，无法区分表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，因此针对表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞都具有攻击性。如针对CD19的CAR-T细胞治疗导致B细胞发育不良，靶向Her-2的CAR-T细胞治疗，都能导致肿瘤部位以外的其他组织或器官遭受攻击，如心肺系统毒性。因此选择合适的肿瘤特异性抗原合成的CAR-T，在攻击肿瘤细胞的同事，能够区分正常的细胞免受攻击。

  3、神经系统毒性

  几个研究组在用CAR-T治疗白血病的过程中，观察到少部分患者出现精神错乱，语言障碍等神经系统不良反应。

  4、其他细胞毒性

  如有引起机体自免疫性疾病的风险。

  因而，研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。

  NK细胞的优势

  NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。

  但是由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。

  CAR-NK主要的优势是：

1、不需要激活NK细胞内源性的细胞毒性受体2、选择性地识别肿瘤相关抗原3、有道抗原特异性的靶细胞裂解4、对实体肿瘤治疗具有明显优势，因为实体肿瘤对非修饰的NK细胞会表现出不同程度的耐受性，但却对抗原依赖型的NK细胞敏感。

  CAR-NK的细胞来源

  理想的供CAR修饰的效应细胞一般需具有以下几个特点：

  4、没有或者具有易控的副作用。

       NK细胞的群体具有异质性，不同群体各具优缺点，选择其中一种合适的效应细胞不仅能够最大程度地发挥CAR修饰的潜能，同时也有助于控制治疗成本，提高临床转化的可能性。

  CAR-NK的细胞来源主要有三种：外周血、NK细胞系和具有分化潜能的干细胞。

  其中主要来源是外周血，在过去十年里，已经有较为有效的方法从外周血和外周血干细胞中纯化扩增足够量的NK细胞用于免疫治疗，并且逐步用于CAR修饰的研发中。自体NK细胞和异体NK细胞都可以进行CAR修饰，但是细胞特性不相同。异体NK细胞供者血液中存在着以T细胞为主的其他淋巴细胞，这些杂细胞的存在会引起植物抗宿主病（GVHD），因此在用于治疗之前，必须要清除T细胞。异体NK细胞由于表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体与患者HLA-I类分子并不匹配，因此并不会产生抑制信号引起干扰，对CAR靶向的肿瘤细胞具有足够的杀伤活性。自体CAR-NK细胞回输后，其抑制受体与自体正常细胞表达的HLA-I类分子结合而产生抑制信号，会抑制NK细胞的杀伤效应。虽然肿瘤细胞丢失了经典的HLA-I类分子，但是非经典的HLA-I类分子的表达（HLA-G、HLA-E等）的表达，同样能够抑制NK细胞的活化。

  除了原代细胞外，NK细胞有许多成熟的细胞系，包括NK-92、NKG、NK-YS、NKL等，其中NK-92在研究中最为广泛。NK-92来源于一名患有非霍奇金淋巴瘤的女性外周血，于1992年建立，是一株IL-2依赖的永生细胞系。其具有强大的细胞毒性，高表达一系列与细胞溶解相关的分子。NK-92表面表达一部分活化性受体，例如NKG2D，急性淋巴白血病细胞这类表达NKG2D配体的肿瘤细胞，对于NK-92的杀伤作用极其敏感。NK-92细胞相较原代NK细胞，最大的优势在于其表面的抑制性受体表达很低，抑制性受体信号的缺失使得其对多种肿瘤的杀伤能力要优于原代NK细胞或者经细胞因子火花的其他杀伤细胞。

  此外，NK-92在实体瘤治疗中也有一定的潜力。CAR-T在实体瘤中效果不佳的重要原因是，肿瘤细胞高表达PD-L1与T细胞表面的刹车分子PD-1结合进而抑制了其杀伤活性，NK-92表面抑制性受体的缺失使之能够避免类似抑制信号的干扰。但是NK-92也存在着一些明显的缺点，例如致瘤性和潜在的EB病毒易感性等。因此，作为安全考虑，NK-92必须经过辐照后才能够使用。

  NK细胞系和外周血来源的NK细胞之外，诱导多能干细胞、脐带血和胚胎干细胞来源的NK细胞同样具有供CAR修饰的潜力。由这些干性细胞分化而来的NK细胞的表型与外周血来源的NK细胞较为相近，且其生长能力更强，能够符合临床应用的要求。

  CAR-NK的抗肿瘤效果

  1、抗血液肿瘤：

  近年来，CAR-T在白血病治疗研究中取得了重大突破，同时也引起了人们对NK细胞在白血病、淋巴癌和多发性骨髓癌等血液肿瘤中效应的关注。CD20和CD19受体修饰的NK-92，与通过基因工程表达CD16而获得具有ADCC功能的NK-92细胞相比，CAR修饰的NK-92细胞对慢性淋巴细胞白血病细胞的清除能力更加显著，说明CAR能够在NK-92中介导比ADCC更加强烈的杀伤作用。

  2、抗实体肿瘤：

  除了血液肿瘤之外， NK-92细胞同样在实体瘤研究中取得显著效果。通过GD2、 HER2、CD138和CS1等肿瘤潜在靶点可以实现对实体瘤的靶向杀伤。ErbB2- CAR修饰的NK-92细胞对HER2阳性的乳腺癌、卵巢癌和上皮细胞癌等肿瘤细胞系的杀伤作用明显增强，在小鼠模型中能够有效减慢肿瘤的生长。GD2受体修饰能够使NK-92靶向恶性胶质瘤细胞和GD2阳性的黑素瘤和乳腺癌细胞并 发挥细胞溶解作用。NK细胞表面活化受体NKG2D的配体在大多数恶性肿瘤细胞中表达。因此利用NK细胞表面NKG2D的胞外区直接与CD3ζ结合，同时以DAP10作为第二信号分子，更大程度地增强NKG2D的表达，放大下游的活化信号，这样的设计在急性淋巴细胞白血病、前列腺癌和横纹肌肉瘤等多种恶性肿瘤细胞系中杀伤效果明显。

  CAR-NK的临床转化