伯豪客户发现黑色素瘤个体化靶向治疗新靶点

摘要

哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是经过临床验证的肿瘤靶标，但PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂是否可用于治疗mTOR基因突变的黑色素瘤患者，目前还有待与临床试验的确认。在该研究中，北京肿瘤医院郭军教授课题组通过Sanger测序方法筛查412例黑色素瘤样本中mTOR的外显子区域基因畸变，并采用Agilent目标序列富集测序验证基因畸变结果。利用转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术构建可稳定表达mTOR突变体的HEK293T细胞，从而分析mTOR突变体功能和功能获得型mTOR突变体对PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂的体外敏感性。该研究文章发表在《Clinical Cancer Research》杂志，影响因子8.722。该研究中Agilent haloplex目标富集测序和数据分析部分由上海伯豪生物提供完成。

研究背景

黑色素瘤是一种侵袭性恶性肿瘤，通常预后效果很差。当前个体化靶向治疗已在黑色素瘤治疗中取得成功。目前成熟的治疗靶点是BRAF和CKIT，其相应的抑制剂药物已经成为NCCN临床实践指南中治疗基因突变黑色素瘤患者的一线治疗方案。

但在中国，黑色素瘤患者中BRAF和CKIT基因突变频率只有25.5%和10.8%，其余的大部分患者仍没有找到有效的靶点应用于黑色素瘤的靶向治疗。PI3K-AKT-mTOR信号通路对肿瘤发生发展的作用非常重要。由于mTOR基因包含58个外显子，编码2549个氨基酸，从而分析mTOR基因畸变和非同义突变引发功能就变得十分困难。目前亚洲患者中常见的肢端和黏膜黑色素瘤病例中，mTOR畸变情况在很大程度上仍还不是很清楚，并且也未见临床上大规模筛查黑色素瘤mTOR畸变的研究报道。

研究思路

研究结果

1. 黑色素瘤mTOR基因畸变

研究者通过对412例黑色素瘤患者DNA测序分析，43例(10.4%)的患者中发生有非同义mTOR突变。而且肢端型和粘膜型黑色素瘤的非同义突变频率比其他黑色素瘤类型更高一些。在所有患者样本中都检测到同义畸变发生，这个结果可能表明mTOR的外显子区域非常不稳定，发生突变频率较高。

非同义突变引起氨基酸变化分布的位置

突变位点在mTOR结构域中的分布

2. mTOR突变与临床病理特征相关性

通过对412例黑色素瘤患者的临床特征统计分析，结果表明mTOR突变与患者年龄、性别、原发灶位置和临床分期并没有直接的相关性。然而却发现mTOR非同义突变患者的中位生存期(43.1 months, 95% CI, 34.8-51.8 months)却显著低于那些没有突变的患者(81.3 months, 95% CI, 60.2-102.4 months; P=0.028)。

对mTOR相关分子磷酸化水平的免疫组化结果表明，mTOR突变很可能主要影响黑色素瘤的p70S6K-S6RP信号通路。

3. mTOR突变体的功能分析

为了研究体细胞mTOR非同义突变是否可以激活mTOR/p70S6K通路，研究者利用TALEN技术对mTOR基因实施定点突变改造，突变体质粒瞬时转染到HEK293T细胞中。Western blot和免疫沉淀的结果显示H1968Y和P2213S突变体在p70S6K磷酸化水平极高，其他突变体在p70S6K的磷酸化水平则较低。

(6道 H1968Y突变体， 8道 P2213S突变体)

研究人员检测H1968Y和P2213S突变体HEK293T细胞中mTOR下游信号通路分子p70S6K、4EBP1和AKT的磷酸化水平，其磷酸化水平与正常型相比都表现出明显升高，这也表明H1968Y和P2213S突变极有可能属于功能获得性突变。

4. mTOR活化突变对PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂药物的敏感性

稳定表达H1968Y和P2213S突变体的HEK293T细胞经过抑制剂药物处理后，发现mTOR相关分子p70SK、4EBP1和AKT的磷酸化水平显著降低。

细胞增殖试验的结果与Western blotting结果一致。无论是对纯合突变体，或是杂合突变体作为研究对象，稳定表达活化突变的HEK293T细胞经个别抑制剂药物处理后，细胞增殖都受到明显抑制作用。将不同抑制剂药物对细胞的抑制效果对比后发现，mTOR突变体可能只对某部分PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂药物敏感，而并非该通路中所有的抑制剂都对其有效。

结论

该研究至少鉴定得到两种mTOR突变体对PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂药物作用敏感。体细胞发生这两种突变的黑色素瘤患者有望通过PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂药物实施靶向治疗。

原文出处：

Kong Y, Si L, Li Y, Wu X, Xu X, Dai J, Tang H, Ma M, Chi Z, Sheng X, Cui C, Guo J.Analysis of mTOR Gene Aberrations in Melanoma Patients and Evaluation of Their Sensitivity to PI3K-AKT-mTOR Pathway Inhibitors. Clin Cancer Res. 2015 Oct 21. PMID:26490311

（转化医学网360zhyx.com）