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腾讯登录无法检测到利用NgAgo进行的DNA引导基因组编辑全文翻译
| 导读 | 前言：昨天《自然-生物技术》就此前发表的韩春雨及同事所著论文“利用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑”发表了“编辑部关注”，并发表Toni Cathomen及同事的通信文章，题为“利用Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) 未能检测到DNA引导的基因组编辑”。今天我们将这篇通信文章全文翻译成中文，供读者参考。由于格式限制，附录图表，方法与数据集请点击“阅读原文”从《自然-生物技术》网站上下载。 |
致编辑：
先前的研究文献报告过使用Argonaute家族蛋白进行的DNA引导的DNA剪切，但由于必须在高温1,2等超生理条件下进行，其实际应用价值一直有限。最近，高峰及同事3报告了将一种从格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi, NgAgo）中分离出的Argonaute（Ago）蛋白作为基因组工程工具，用于编辑人类基因组。在使用编码NgAgo的质粒DNA和长24个核苷酸长度、5'端磷酸化的单链向导DNA（gDNA）转染人类细胞系后，他们在内源性靶点实现了基因编辑。
在本文中，我们报告了三支研究团队（Cathomen,附录图片.1 和附录方法1; Ekker, 附录图片. 2 和附录方法2;以及Kim, 附录图片.3 和附录方法3）独立尝试重复高峰及同事3的实验的结果，他们侧重寻找在人工培养的人类细胞系中发生了DNA编辑的证据。他们都合成了同一种5'端磷酸化gDNA序列，使用了高峰及同事3通过Addgene（美国马萨诸塞州剑桥市）提供的NgAgo载体来转染同样的细胞系，并分析了基因组DNA，以寻找基因编辑的迹象。
对照组证实，质粒DNA和gDNA都得到了有效递送，NgAgo蛋白也成功表达。然而尽管各团队多次在报告的三株细胞系中尝试优化NgAgo介导的基因组编辑过程，他们最终仍然没有发现NgAgo能编辑内源性靶序列的证据。
高峰及同事的论文中3使用了一种附着体增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记基因作为优化NgAgo平台的靶点。Cathomen团队使用了同样的实验设置来阻断海拉细胞和HEK293T细胞的附着体EGFP表达质粒，但未能检测到任何统计显著的EGFP表达降低（附录图1a）。此外，无论是使用从Addgene取得的编码NgAgo的质粒，还是其它通过在哺乳动物表达载体中亚克隆NgAgo序列产生的质粒（附录图1b,c），他们都未能在人类U2OS细胞中检测到整合的EGFP标记基因的任何显著阻断。
与之相比，在海拉细胞和HEK293T细胞（未展示）的附着体测定中，编码了基于产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（SpCas9）以及特异性gRNA 的RNA引导性核酸酶的质粒却可将EGFP表达在受转染细胞中降低至原本的十四分之一，此外在被转染的U2OS细胞中约80%EGFP都可被（SpCas9）及gRNA敲除。这表明，这些细胞系中质粒DNA是可以被有效递送的，同时这些质粒也能有效表达其上编码的DNA核酸内切酶。
通过在四个人类细胞系3中DYRK1A基因上的数个靶点进行测试，高峰及同事的论文3展示了NgAgo在生理条件下稳定地编辑人类基因组的能力。本文中，在这四个细胞系中，Ekker的团队使用了HEK293、海拉和K562细胞，并用NgAgo表达质粒以及与原论文中的G5, G6, G10,G12和G13对应的5个gDNA对它们进行转染。为了测试NgAgo诱导的基因编辑，研究者从转染细胞中抽提出了基因组DNA, 并对其进行了PCR扩增和TIDE（通过分解追踪插入/缺失）分析4（附录数据集2）。
在对所有样本中（每个gDNA N=3, 共45个样本）的DNA色谱分析中，我们都没能在检测阈值（2%；附录图2a）以上找到发生了稳定的DNA序列改变的任何证据。由于原论文报告NgAgo与这些向导DNA的基因编辑效率高于20%，2%的检测阈值应足以识别出类似的基因编辑活动。假设这些样本中产生插入/缺失变异的效率呈正态分布，所有样本都没有出现任何de novo插入/缺失的概率小于0.0001。我们假设NgAgo诱导的插入/缺失的真实频率为0.2，且呈正态分布，以“NgAgo不会在人类细胞中以大于或等于0.2的效率诱导插入/缺失”为零假设。在检测45个独立样本后，没有观察到任何插入/缺失的证据的概率是p=0.845=4.4 × 10(–5)。此外，对45个来自海拉细胞样本的亚克隆聚群的并行序列分析也没能找到任何插入/缺失的证据（数据未展示）。虽然证据明确显示，这一系统中的所有所列组分都成功完成了细胞递送，但这些独立重复实验都未能检测到任何有关NgAgo诱导的基因编辑的明确证据。
高峰及同事3报告称，他们成功在其它人类基因位点，包括EMX1、GATA4和GRIN2B上进行了基因编辑(附录图3a)。Kim实验室通过脂质转染(附录图3b–e)或电穿孔方法(附录图3f–j)将gDNA和NgAgo表达质粒递送至HEK293或海拉细胞。同时也在培养基中添加了NgAgo取得催化活性所需的Mg2+阳离子附录图3k)。他们运用了T7E1 (T7核酸内切酶I)测定5和靶向深度测序(NCBI SRA: SRX2161446)来检测NgAgo诱导的突变。在所分析的四个位点（DYRK1A、EMX1、GATA4和GRIN2B），NgAgo都没有产生频率高于测序误差率(~0.1%)的插入/缺失。此外，Cathomen小组运用T7E1 测定5或TIDE分析(附录图1c,d, 附录数据集1)，都无法在CCR5位点检测到基因编辑痕迹。与之相反，在这些实验中被用作对照的SpCas9核酸酶都能成功诱导DNA插入/缺失（频率在3%-73%之间）(附录图. 1d and 3b–k)。
为证实所采用的gDNA分子在5?端已化学磷酸化，Kim实验室进行了质谱分析(附录图3m)。为证实质粒DNA和假定的向导DNA共递送有效，他们共同转染了有3?-Alexa Fluor 594标记的G5 gDNA以及由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的EGFP表达质粒(pEGFP-N1)。由于在含有核定位信号(NLS)的N端修饰的NgAgo表达也受CMV启动子驱动，Ekker实验室将EGFP表达作为NgAgo在这些细胞中的替代标记。在脂质转染4/12/24小时后，他们使用多聚甲醛固定了海拉和HEK293细胞，并将盖玻片覆在了载玻片上。4小时后，他们在细胞内部观察到了与AlexaFluor 594对应的强烈红色荧光，并至少持续了24小时(附录图2b)。在4小时时，红色荧光在细胞内弥散开来，但随后呈现荧光点状。正如预期，在转染4小时后可以观察到一些EGFP荧光，而在12和24小时后能检测到更加强烈的信号。PCR测定也证实了NgAgo质粒的递送(附录图2c)。为了证实NgAgo在转染细胞内的表达，他们利用定性反转录PCR(RT-PCR;附录图1e)、对血球凝集素(HA)标记的NgAgo的免疫印迹分析(附录图1f, 3n)，或对DsRed标记的NgAgo的流式细胞分析(附录图1f)确定了RNA或蛋白质表达的程度。综合而言，这些数据表明，质粒DNA和gDNA被有效递送至此处所用的人类细胞系中，而且所有被测细胞均能表达NgAgo。
基于以上数据，我们认为在重复高峰及同事3原论文实验的条件下，仅仅通过共递送编码NgAgo的质粒DNA和5?-磷酸化单链gDNA，不足以在培养的人类细胞中诱导原文所述插入/缺失频率的基因编辑。
致谢
我们感谢实验室所有成员为验证NgAgo基因组编辑所作的宝贵贡献。以下机构为本研究提供了经费支持：德国联邦教育及研究部(BMBF-01EO0803，致T.C.)、美国心脏协会(16PRE30470004，致H.A.)、美国国立卫生研究院(GM63904，致S.C.E.)、梅奥基金会(致H.A.,S.N., Z.L., 和S.C.E.)和韩国基础科学研究院（IBSR021-D1，致J.-S.K.）。
利益冲突声明
S.C.E. 是Lifengine科技有限公司的共同创始人；T.C.是TRACR血液学的顾问；J.-S.K是ToolGen有限公司的共同创始人与股东。
编辑注：本文已经过同行评议。
作者信息
Seung Hwan Lee1,10,
Giandomenico Turchiano2,3,10,
Hirotaka Ata4,10, Somaira Nowsheen4,
Marianna Romito2,3,5, Zhenkun Lou6,
Seuk-Min Ryu1,7, Stephen C Ekker8,
Toni Cathomen2,3,9 & Jin-Soo Kim1,7
1韩国，首尔，韩国基础科学研究院基因组工程中心
2德国，弗莱堡，弗莱堡大学医学中心细胞和基因疗法研究所
3德国，弗莱堡，弗莱堡大学医学中心慢性免疫缺陷中心
4美国，明尼苏达州，梅奥诊所，梅奥研究生院
5德国，弗莱堡，弗莱堡大学生物学部研究生院
6美国，明尼苏达州，梅奥诊所，肿瘤研究部
7韩国，首尔，首尔国立大学化学部
8美国，明尼苏达州，梅奥诊所，生物化学与分子生物学部
9德国，弗莱堡，弗莱堡大学医学部
10这些作者为本研究作出了同等贡献。
联系方式： T.C.(toni.cathomen@uniklinik-freiburg.de),S.C.E(ekker.stephen@mayo.edu), or J.-S.K.(jskim01@snu.ac.kr).
参考资料
Swarts, D.C. et al. Nature 507, 258–261 (2014).
Swarts, D.C. et al. Nucleic Acids Res. 43, 5120–5129 (2015).
Gao, F., Shen, X.Z., Jiang, F., Wu, Y. & Han, C. Nat. Biotechnol. 34, 768–773 (2016).
Brinkman, E.K., Chen, T., Amendola, M. & van Steensel, B. Nucleic Acids Res. 42, e168(2014).
Kim, H.J., Lee, H.J., Kim, H., Cho, S.W. & Kim, J.S. Genome Res. 19, 1279–1288 (2009). ?
先前的研究文献报告过使用Argonaute家族蛋白进行的DNA引导的DNA剪切，但由于必须在高温1,2等超生理条件下进行，其实际应用价值一直有限。最近，高峰及同事3报告了将一种从格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi, NgAgo）中分离出的Argonaute（Ago）蛋白作为基因组工程工具，用于编辑人类基因组。在使用编码NgAgo的质粒DNA和长24个核苷酸长度、5'端磷酸化的单链向导DNA（gDNA）转染人类细胞系后，他们在内源性靶点实现了基因编辑。
在本文中，我们报告了三支研究团队（Cathomen,附录图片.1 和附录方法1; Ekker, 附录图片. 2 和附录方法2;以及Kim, 附录图片.3 和附录方法3）独立尝试重复高峰及同事3的实验的结果，他们侧重寻找在人工培养的人类细胞系中发生了DNA编辑的证据。他们都合成了同一种5'端磷酸化gDNA序列，使用了高峰及同事3通过Addgene（美国马萨诸塞州剑桥市）提供的NgAgo载体来转染同样的细胞系，并分析了基因组DNA，以寻找基因编辑的迹象。
对照组证实，质粒DNA和gDNA都得到了有效递送，NgAgo蛋白也成功表达。然而尽管各团队多次在报告的三株细胞系中尝试优化NgAgo介导的基因组编辑过程，他们最终仍然没有发现NgAgo能编辑内源性靶序列的证据。
高峰及同事的论文中3使用了一种附着体增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记基因作为优化NgAgo平台的靶点。Cathomen团队使用了同样的实验设置来阻断海拉细胞和HEK293T细胞的附着体EGFP表达质粒，但未能检测到任何统计显著的EGFP表达降低（附录图1a）。此外，无论是使用从Addgene取得的编码NgAgo的质粒，还是其它通过在哺乳动物表达载体中亚克隆NgAgo序列产生的质粒（附录图1b,c），他们都未能在人类U2OS细胞中检测到整合的EGFP标记基因的任何显著阻断。
与之相比，在海拉细胞和HEK293T细胞（未展示）的附着体测定中，编码了基于产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（SpCas9）以及特异性gRNA 的RNA引导性核酸酶的质粒却可将EGFP表达在受转染细胞中降低至原本的十四分之一，此外在被转染的U2OS细胞中约80%EGFP都可被（SpCas9）及gRNA敲除。这表明，这些细胞系中质粒DNA是可以被有效递送的，同时这些质粒也能有效表达其上编码的DNA核酸内切酶。
通过在四个人类细胞系3中DYRK1A基因上的数个靶点进行测试，高峰及同事的论文3展示了NgAgo在生理条件下稳定地编辑人类基因组的能力。本文中，在这四个细胞系中，Ekker的团队使用了HEK293、海拉和K562细胞，并用NgAgo表达质粒以及与原论文中的G5, G6, G10,G12和G13对应的5个gDNA对它们进行转染。为了测试NgAgo诱导的基因编辑，研究者从转染细胞中抽提出了基因组DNA, 并对其进行了PCR扩增和TIDE（通过分解追踪插入/缺失）分析4（附录数据集2）。
在对所有样本中（每个gDNA N=3, 共45个样本）的DNA色谱分析中，我们都没能在检测阈值（2%；附录图2a）以上找到发生了稳定的DNA序列改变的任何证据。由于原论文报告NgAgo与这些向导DNA的基因编辑效率高于20%，2%的检测阈值应足以识别出类似的基因编辑活动。假设这些样本中产生插入/缺失变异的效率呈正态分布，所有样本都没有出现任何de novo插入/缺失的概率小于0.0001。我们假设NgAgo诱导的插入/缺失的真实频率为0.2，且呈正态分布，以“NgAgo不会在人类细胞中以大于或等于0.2的效率诱导插入/缺失”为零假设。在检测45个独立样本后，没有观察到任何插入/缺失的证据的概率是p=0.845=4.4 × 10(–5)。此外，对45个来自海拉细胞样本的亚克隆聚群的并行序列分析也没能找到任何插入/缺失的证据（数据未展示）。虽然证据明确显示，这一系统中的所有所列组分都成功完成了细胞递送，但这些独立重复实验都未能检测到任何有关NgAgo诱导的基因编辑的明确证据。
高峰及同事3报告称，他们成功在其它人类基因位点，包括EMX1、GATA4和GRIN2B上进行了基因编辑(附录图3a)。Kim实验室通过脂质转染(附录图3b–e)或电穿孔方法(附录图3f–j)将gDNA和NgAgo表达质粒递送至HEK293或海拉细胞。同时也在培养基中添加了NgAgo取得催化活性所需的Mg2+阳离子附录图3k)。他们运用了T7E1 (T7核酸内切酶I)测定5和靶向深度测序(NCBI SRA: SRX2161446)来检测NgAgo诱导的突变。在所分析的四个位点（DYRK1A、EMX1、GATA4和GRIN2B），NgAgo都没有产生频率高于测序误差率(~0.1%)的插入/缺失。此外，Cathomen小组运用T7E1 测定5或TIDE分析(附录图1c,d, 附录数据集1)，都无法在CCR5位点检测到基因编辑痕迹。与之相反，在这些实验中被用作对照的SpCas9核酸酶都能成功诱导DNA插入/缺失（频率在3%-73%之间）(附录图. 1d and 3b–k)。
为证实所采用的gDNA分子在5?端已化学磷酸化，Kim实验室进行了质谱分析(附录图3m)。为证实质粒DNA和假定的向导DNA共递送有效，他们共同转染了有3?-Alexa Fluor 594标记的G5 gDNA以及由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的EGFP表达质粒(pEGFP-N1)。由于在含有核定位信号(NLS)的N端修饰的NgAgo表达也受CMV启动子驱动，Ekker实验室将EGFP表达作为NgAgo在这些细胞中的替代标记。在脂质转染4/12/24小时后，他们使用多聚甲醛固定了海拉和HEK293细胞，并将盖玻片覆在了载玻片上。4小时后，他们在细胞内部观察到了与AlexaFluor 594对应的强烈红色荧光，并至少持续了24小时(附录图2b)。在4小时时，红色荧光在细胞内弥散开来，但随后呈现荧光点状。正如预期，在转染4小时后可以观察到一些EGFP荧光，而在12和24小时后能检测到更加强烈的信号。PCR测定也证实了NgAgo质粒的递送(附录图2c)。为了证实NgAgo在转染细胞内的表达，他们利用定性反转录PCR(RT-PCR;附录图1e)、对血球凝集素(HA)标记的NgAgo的免疫印迹分析(附录图1f, 3n)，或对DsRed标记的NgAgo的流式细胞分析(附录图1f)确定了RNA或蛋白质表达的程度。综合而言，这些数据表明，质粒DNA和gDNA被有效递送至此处所用的人类细胞系中，而且所有被测细胞均能表达NgAgo。
基于以上数据，我们认为在重复高峰及同事3原论文实验的条件下，仅仅通过共递送编码NgAgo的质粒DNA和5?-磷酸化单链gDNA，不足以在培养的人类细胞中诱导原文所述插入/缺失频率的基因编辑。
致谢
我们感谢实验室所有成员为验证NgAgo基因组编辑所作的宝贵贡献。以下机构为本研究提供了经费支持：德国联邦教育及研究部(BMBF-01EO0803，致T.C.)、美国心脏协会(16PRE30470004，致H.A.)、美国国立卫生研究院(GM63904，致S.C.E.)、梅奥基金会(致H.A.,S.N., Z.L., 和S.C.E.)和韩国基础科学研究院（IBSR021-D1，致J.-S.K.）。
利益冲突声明
S.C.E. 是Lifengine科技有限公司的共同创始人；T.C.是TRACR血液学的顾问；J.-S.K是ToolGen有限公司的共同创始人与股东。
编辑注：本文已经过同行评议。
作者信息
Seung Hwan Lee1,10,
Giandomenico Turchiano2,3,10,
Hirotaka Ata4,10, Somaira Nowsheen4,
Marianna Romito2,3,5, Zhenkun Lou6,
Seuk-Min Ryu1,7, Stephen C Ekker8,
Toni Cathomen2,3,9 & Jin-Soo Kim1,7
1韩国，首尔，韩国基础科学研究院基因组工程中心
2德国，弗莱堡，弗莱堡大学医学中心细胞和基因疗法研究所
3德国，弗莱堡，弗莱堡大学医学中心慢性免疫缺陷中心
4美国，明尼苏达州，梅奥诊所，梅奥研究生院
5德国，弗莱堡，弗莱堡大学生物学部研究生院
6美国，明尼苏达州，梅奥诊所，肿瘤研究部
7韩国，首尔，首尔国立大学化学部
8美国，明尼苏达州，梅奥诊所，生物化学与分子生物学部
9德国，弗莱堡，弗莱堡大学医学部
10这些作者为本研究作出了同等贡献。
联系方式： T.C.(toni.cathomen@uniklinik-freiburg.de),S.C.E(ekker.stephen@mayo.edu), or J.-S.K.(jskim01@snu.ac.kr).
参考资料
Swarts, D.C. et al. Nature 507, 258–261 (2014).
Swarts, D.C. et al. Nucleic Acids Res. 43, 5120–5129 (2015).
Gao, F., Shen, X.Z., Jiang, F., Wu, Y. & Han, C. Nat. Biotechnol. 34, 768–773 (2016).
Brinkman, E.K., Chen, T., Amendola, M. & van Steensel, B. Nucleic Acids Res. 42, e168(2014).
Kim, H.J., Lee, H.J., Kim, H., Cho, S.W. & Kim, J.S. Genome Res. 19, 1279–1288 (2009). ?
Nature|doi:10.1038/nbt.3753
（转化医学网360zhyx.com）
评论：
共有 2 条评论
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游客2016-12-04 11:45:46脸丢到国际了。
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游客2016-12-02 10:53:42学术造假在中国泛滥。为什么？急功近利。害人不浅。
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