2017热词预测之单细胞测序之神来之笔

最近几年，关于单细胞测序的报道日益增多。事实上，单细胞测序是一个新兴的领域。单细胞测序分为单细胞转录组测序和单细胞基因组测序。单细胞转录组测序分为：单细胞DGE、单细胞polyA测序、单细胞lncRNA测序。单细胞基因组测序分为：单细胞外显子组测序和单细胞全基因组重测序。

据了解，单细胞测序萌芽于2010年，2013年是单细胞基因组学突飞猛进的一年。2013年谢晓亮教授哈佛大学课题组与北京大学BIOPIC李瑞强研究员小组合作，将创建的MALBAC技术应用于人类单个精子基因组的测序研究中。

Nature Reviews Genetics杂志发表的一篇重要综述，该文章认为重点关注用单细胞基因组测序研究微生物暗物质，评估多细胞生物中遗传嵌合现象的致病作用，尤其是癌症。但，单细胞测序在生殖领域的应用同样不容小觑。

单细胞发展的历史

据了解，1990年，Norman Iscove的课题组首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的，他们用 PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增。2012年7月，来自斯坦福大学的Stephen Quake在Cell上发表了一篇文章《Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm》，研究采用单细胞测序的方法，测定了来自一项研究的100个精子的重组率，发现了许多新的重组热点和与间接方法发现的相一致的比率。同年，纽约冷泉港实验室的研究生Timour Baslan正利用单细胞技术来研究癌细胞。2014年1月《自然—方法学》（Nature Methods）上发表年度特别报道，将“单细胞测序”（Singled out for sequencing）的应用列为2013年度最重要的方法学进展。2015基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元，可见单细胞测序在当前基因组学前沿研究中的热度。

单细胞测序为何赢得众生命科学家们火热的心？

因为即使来源相同的单个细胞，由于随机生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存在差异，即细胞的异质性。

单细胞测序较传统测序而言有不可比拟的优势。在单细胞层面，所有的疾病在病理学上都是不一样的。单细胞研究能够帮助我们更好地认识为什么有些细胞生病了，而另外一些细胞却还是正常的；也能够告诉我们为什么有些细胞对药物的敏感性非常高，可是另外一些细胞对药物却“无动于衷”。

常见的基因组测序技术避免不了这一现象带来的影响，基于这一原因，研究人员开启了单细胞测序技术的探索之路。单细胞测序技术可谓是生物科技发展史上的一大创举。

单细胞测序赢得多家生物公司“芳心”

2016年1月11日，Illumina和Bio-Rad宣布合作开发一项单细胞测序流程。本次合作中双方优势互补，利用Bio-Rad一流的微滴分液技术和Illumina领先的NGS（next-generation sequencing）技术，开发出一款可以分析单个细胞遗传信息的新技术。

2016年1月11日，Juno宣布收购了AbVitro，AbVitro拥有世界领先的单细胞测序平台。Juno在是CAR-T免疫治疗领域独霸一方，它为什么要收购AbVitro呢？传统的细胞免疫治疗在寻找结合靶点时通常会忽略掉那些含量很低的靶点，然而这些忽略掉的靶点就可能成为癌症复发转移的关键。Juno打算利用AbVitro的单细胞测序技术尽可能多的分析癌细胞上的靶点。从理论上讲，如果可以找到癌细胞所有的靶点，免疫疗法就可以干掉所有的癌细胞，这样就可以有效的避免癌症的复发转移。

2016年2月11日，基因测序领域的黑马10X Genomics宣布推出旗舰级测序新品Chromium，Chromium最为耀眼的功能是可以实现单细胞测序。

单细胞测序技术也在国内获得了政策上的支持

2016年3月8日，科技部下发了《国家重点研发计划2016年度项目申报指南》的通知，其中“精准医学研究”作为其中之一被列入优先启动的重点专项，指南中明确提出：要通过对单细胞组学技术的研发，建立单细胞的高通量快速分离、捕获、提取及测序技术；从而深入推进单细胞技术在重大及罕见疾病临床研究和治疗中的应用。

作为上述研究的目标和基础，建成“单个细胞基因组的均匀、无偏、精准扩增和高通量测序技术”和“整合的单细胞多组学高通量测序技术”等内容被明确的提出将作为项目的考核指标，相关领域研究在未来五年将受到国家重点扶持。

那么，单细胞测序有哪些具体的应用呢？

单细胞测序技术在癌症研究中发挥重要的作用

2012年3月，华大基因研发了一种解析单细胞基因组的新方法，应用于原发性血小板增多症（一种血癌）和肾透明细胞癌（一种肾癌）的肿瘤内部遗传特征研究，解决了之前在用组织样本测序时无法解决的肿瘤高异质性难题，为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、发展机制及其诊断、治疗开辟了新方向。

2012年5月，在冷泉港实验室的基因组生物学会议上，MD安德森癌症中心的遗传学家Nicholas Navin提交了单细胞分辨率乳腺癌遗传学的新数据。6月，Navin改良了他的技术使得它能够敏感地检测到单个核苷酸的差异，并且他已经在来自一个浸润性乳腺癌肿瘤的一组4个细胞中发现单个细胞通常包含数十个罕见突变，这些突变采用大型肿瘤测序方法通常无法检测到。

2012年7月，一项新研究首次表明一种称为Smart-Seq的新基因组测序方法可以帮助科学家们深入分析临床相关的单细胞。Smart-Seq有许多可能的应用，包括帮助科学家们更好地了解肿瘤形成的复杂性。

2013年12月， BIOPIC白凡研究员和谢晓亮教授团队与北京大学肿瘤医院的王洁教授团队合作共同在《PNAS》上发表文章，对于癌症病人单个外周血循环肿瘤细胞（CTC）的全基因组、外显子组进行了高通量测序，发现在某一类肺癌患者的所有循环肿瘤细胞中存在着一种特定的基因拷贝数变异（CNV）模式，而不同癌种CTC细胞的基因组拷贝数变异模式不同，为癌症的早期诊断提供了全新的契机。这也是国际上首次实现对外周血循环肿瘤细胞基因组的高通量测序，标志着利用循环肿瘤细胞基因组测序信息进行肿瘤无创诊断时代的到来。

单细胞测序技术在生殖领域的应用

2014年9月19日，世界首例经MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles，是目前最先进的单细胞全基因组扩增技术）基因组扩增高通量测序进行单基因遗传病和染色体异常同时筛查的试管婴儿在北京大学第三医院诞生，这标志着我国胚胎植入前遗传诊断（PGD）技术已处于世界领先水平。

2015年12月10日，解放军总医院诞生了一对特殊的双胞胎—国内首例应用单细胞扩增技术（MALBAC）同时进行PGD/PGS阻断了遗传性耳聋的健康双胞胎。

2016年3月，全球首个接受无创胚胎染色体筛查(NICS)的试管婴儿日前在无锡市妇幼保健院生殖中心健康诞生，标志着我国胚胎植入前遗传学筛查技术已处于世界领先水平。此次的NICS技术在保持高检测结果准确率的同时，对样本的提取手段进行了革新，即从活检取材变为培养液采集。这使得样本提取更易操作，也更有助于该类筛查在基层医院及生殖中心的普及和应用，造福更多有需要的中国家庭。

下面，让我们来看看目前国内的单细胞测序技术有哪些？

1、Strand-seq：主要研发人—加拿大英属哥伦比亚大学Peter Lansdorp。Strand-seq方法能分别对单细胞的双亲DNA模板链进行测序，获得高分辨率的姊妹染色体交换图谱，检测到基因重排，从而发现细胞复制过程中，DNA序列的翻转或交换。利用Strand-seq方法，研究人员完成了单链DNA测序，并发现了首个基因组压力和不稳定性的痕迹。

2、基于芯片实验室技术的单细胞测序：主要研发人—斯坦福大学Stephen Quake。该技术设计了一种路线，用液体载运细胞通过一连串显微管道和微阀门，当细胞挨个进入各自的小空位时，它们的DNA就会被提取出来，经过复制用于进一步分析。此外，还能用化学试剂将细胞混合起来，通过检测反应过程中的荧光发射获得它们的基因编码。所有这些都能在芯片上完成，不仅操作简单，而且成本效益高。Stephen Quake已利用此技术完成了第一例人类单细胞测序，现在他正利用这项技术研究精子细胞中的重组并分析突变率。

3、MALBAC：多重退火和成环循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles），主要研发人—哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓亮教授。该技术能够降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。

4、G&T Seq：单细胞基因组与转录组平行测序技术（Genome and Transcriptome Sequencing），该技术实现了对单个细胞内的DNA和RNA平行测序，能够展现单个细胞的基因变异与基因功能之间的关系。G&T-Seq这一整合的技术的重要意义在于可以分析单细胞基因型和表现型之间的关系，深刻揭示一个细胞内的DNA信息指导细胞状态的调控机制。

总而言之，单细胞测序技术登上转化医学大舞台，靠的不是“颜值”。它以自己独特的魅力影响人们的健康，帮助我们攻克一个个难关，助力人类大健康事业！（转化医学网360zhyx.com）