揭开外泌体的神秘面纱

液态活检已经被评为2015年度十大突破性技术之一，并且在2015年12月的《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》中规范了中国EGFR的血液检测，以期能够推动肺癌的精准治疗，这无疑显示出了这项技术的巨大进步以及在临床应用中的巨大潜力。

液态活检按照检测的对象分类，可以分为核酸水平的ctDNA检测和细胞水平的循环肿瘤细胞（CTC）检测以及外泌体（Exosome）检测。随着液态活检技术的广泛应用，人们已经对CTC和ctDNA有了较为深入的了解，也开发出很多基于CTC和ctDNA检测技术的平台，但是对作为液态活检“三驾马车”之一的外泌体（Exosome）却研究的很少，一直以来科学界对其均没有给予足够的重视，所以关于其作用机制的研究也不够深入和透彻。不过随着美国科学家詹姆斯·罗斯曼、兰迪·谢克曼和德国科学家托马斯·苏德霍夫因为在发现细胞囊泡运输系统及其运行调节机制研究中的杰出贡献而荣获诺贝尔医学奖，这种外泌体（Exosome）被忽视的情况正在发生改变，很多研究机构和课题小组开始重视对外泌体（Exosome）的研究，相关文献不断被报道出来，增进了人们对外泌体（Exosome）的认知。本文着重从什么是外泌体，外泌体的生理功能以及未来的应用前景等方面进行介绍。

外泌体（Exosome）一词最早出现在1981年，但是直到2007年发现外泌体（Exosome）可以作为细胞间基因交流的机制时，才重新激发了人们对外泌体（Exosome）研究的兴趣。随着科学研究的不断深入，目前已经发现外泌体（Exosome）是由通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体，多泡内涵体再与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm的膜性囊泡。外泌体（Exosome）内含物的很大部分是蛋白质，如：CD9、CD63、CD81、MHC-I等；肿瘤细胞产生的外泌体（Exosome）中还可以检测到过度表达的特异性的蛋白标志物，如TRAIL和TGF-β等。除已经发现的蛋白质外，外泌体（Exosome）中还含有大量的mRNA、miRNA、cirRNA和DNA片段等成分，由于这些内容物的存在提供了丰富的生物信息，可以多方位、多角度的揭示出疾病信息，这就蕴藏了巨大潜力。而且，外泌体（Exosome）来源广泛，淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等都可以分泌外泌体，被分泌出的外泌体（Exosome）还会进入羊水，腹水，唾液，血液，乳汁，尿液中，这就极大地拓展了检测途径，使临床检测变为可能。

外泌体（Exosome）最初被认为是毫无作用的“垃圾”，但随着研究的不断深入，人们发现事实并非如此，外泌体（Exosome）是具有功能活性并可进行细胞间信息传递的微囊泡，其可以介入机体免疫、新陈代谢以及肿瘤生长和产生耐药性各个方面。

１.外泌体（Exosome）介导肿瘤细胞的增殖过程。肿瘤细胞通过与自身微环境的信息交流促进肿瘤细胞的增殖，而外泌体（Exosome）可以充当这种信息载体。当细胞中出现基因突变时，外泌体（Exosome）会通过膜融合把这种突变信息传递至其他的正常细胞，从而导致原癌基因的激活、抗凋亡基因的表达，使肿瘤细胞获得增殖特性。肿瘤细胞来源的外泌体（Exosome）还可以通过直接抑制免疫细胞，促进肿瘤细胞逃避免疫监视，为肿瘤细胞在体内生长创造条件。

2.外泌体（Exosome）介导肿瘤血管的形成和转移。外泌体（Exosome）能将自身的细胞因子IL-8和VEGF释放到细胞外，作用于内皮细胞膜表面受体，导致肿瘤血管快速形成并最终通过发生EMT过程促进肿瘤的迁移。肿瘤细胞来源的外泌体（Exosome）中含有血管生长素、血管内皮生长因子等，这些细胞因子以不同的作用方式促进肿瘤血管的形成，如VEGF通过激活磷酸酯酶C和第二信使的形成，诱导纤维蛋白溶解酶原活化物的表达，使得基底膜降解，从而促进肿瘤细胞的迁移。

3.外泌体（Exosome）介导肿瘤细胞的免疫耐受。肿瘤细胞来源的外泌体（Exosome）本身可作为肿瘤抗原，因此，肿瘤来源的外泌体（Exosome）既是一种抗原呈递系统，同时也是肿瘤排斥抗原的来源。肿瘤来源的外泌体（Exosome）能够通过传递某些抑制信号，在机体免疫应答过程中起负性调节作用，诱导肿瘤细胞形成免疫耐受，从而逃避免疫细胞的杀伤。

4.外泌体（Exosome）介导肿瘤细胞的化疗抵抗。在肿瘤的治疗过程中经常会出现药物耐受，使化疗失败，这其中外泌体（Exosome）以多种途径参与了化疗抵抗这一过程。通常，发生EMT过程的肿瘤细胞可获得抵抗凋亡能力，而抵抗凋亡通常使肿瘤表现为化疗抵抗。肿瘤细胞来源的外泌体（Exosome）能通过传递相关的组织因子(如VEGF、TGF2β)介导细胞发生EMT，从而增加肿瘤细胞的化疗抵抗能力。

目前国内在液态活检领域主要集中在CTC和ctDNA，外泌体（Exosome）还鲜有涉及，而美国企业具有一定的技术优势，目前已经开发的可用于外泌体分析的技术有：超速离心法（最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒）、密度梯度离心法（通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集）、超滤离心（利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体）、磁珠免疫法（外泌体表面有其特异性标记物，用包被相应抗体的磁珠与外泌体共同孵育后，即可将外泌体吸附并分离出来）、PEG-base沉淀法（聚乙二醇可与疏水性分子结合共沉淀，被用来沉淀外泌体）、新一代测序分析（从癌症患者的体液中分离出外泌体，对其中的DNA、RNA进行全基因组、外显子组和转录组测序分析，筛查肿瘤细胞来源的基因突变情况）。

肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体（Exosome）释放到周围环境中去，同时，外泌体（Exosome）能在4℃保存96h，或是在-70℃下保存更长时间，可以从患者的体液中分离外泌体（Exosome）用于早期临床诊断。随着技术的进步，已经有生物公司尝试涉足外泌体领域，如Codiak BioSciences公司（检测胰腺癌癌细胞外泌体中所包含的一种蛋白Glypican-1，这种蛋白有可能作为一种非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌）；Exosome Diagnostics公司推出全球首个基于外泌体（Exosome）RNA的液态活检产品：ExoDx Lung（ALK）（是一种基于血浆外泌体（Exosome）的诊断产品，可准确检测非小细胞肺癌患者的EML4-ALK突变）。还有外泌体（Exosome）中存在黑色素瘤标志物包括MIA、S100B和酪氨酸酶相关蛋白2，且黑色素瘤患者胞外体中MIA和S100B浓度显着高于健康人群和非黑色素瘤患者，通过检测MIA和S100B表达水平对黑色素瘤的诊治具有积极地参照作用。

从本质上说，液态活检是分子诊断在样本来源上的延伸，进一步丰富了检测手段，而随着外泌体的不断揭秘，相信其会在液态活检中发挥越来越重要的作用。

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