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腾讯登录Cell：科学家首次观察到CRISPR-Cas3切割DNA关键步骤，防止脱靶或成可能！
| 导读 | 日前，哈佛医学院和康奈尔大学的科学家首次观察到CRISPR复合物捕获DNA的细节，且揭示了其作用机制的关键步骤。研究结果于6月29日发表在Cell杂志，为提高CRISPR医学应用的效率和准确性提供了必要的结构数据。 |
日前，哈佛医学院和康奈尔大学的科学家首次观察到CRISPR复合物捕获DNA的细节，且揭示了其作用机制的关键步骤。研究结果于6月29日发表在Cell杂志，为提高CRISPR医学应用的效率和准确性提供了必要的结构数据。
通过低温电子显微镜，研究人员首次观察到CRISPR复合物靶向目标DNA链，并准备通过Cas3酶切割DNA的全过程。研究人员说，这些高分辨率结构揭示了错误检测的过程，即一种分子冗余，可以防止意外的基因组损伤。
CRISPR-Cas3是CRISPR-Cas系统的亚型，是生物医学研究中广泛应用的精密基因编辑分子工具。然而，在其作用机制方面，特别是如何捕获靶DNA，目前尚不清楚，意外脱靶效应是CRISPR-Cas治疗人类疾病的一大安全性问题。
这些高分辨率结构细节阐明了使用CRISPR进行基因编辑时确保准确性并避免脱靶效应的方法。
哈佛医学院细胞生物学助理教授兼该研究资深作者说：“要解决特异性问题，我们需要了解CRISPR复合物形成的每一关键步骤。我们的研究显示了CRISPR捕获DNA的准确机制，从初始识别靶DNA以及靶向过程，使得DNA可以通过Cas3进行最终切割。”
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CRISPR-Cas是一种适应性防御机制，细菌用来抵御病毒入侵。该过程涉及细菌捕获病毒DNA，然后将其整合到细菌基因组中，并产生称为crRNA（CRISPR RNA）的短RNA序列。这些crRNA片段用于发现“敌人”的存在。
像条形码一样，crRNA被添加到CRISPR酶成员身上，它们具有监测外来代码的哨兵的功能。如果这些复合体遇到与其crRNA相匹配的遗传物质，则会切断该DNA使其无害化。
为了更好地了解CRISPR-Cas的功能，研究团队专注于1型CRISPR，其为细菌中最常见的亚型，其利用称为CRISPR级联的蛋白复合物捕获DNA，酶Cas3用于切割外源DNA。
眼见为实
CRISPR-Cas3中，crRNA被添加到CRISPR蛋白复合物上，CRISPR复合物识别一种称为PAM的非常短的DNA序列，其指示外源病毒DNA的存在。
研究团队发现，随着CRISPR蛋白复合物识别PAM序列，CRISPR使DNA形成一定角度的弯曲，迫使DNA的一小部分变松。从而使得11个核苷酸的crRNA片段与靶DNA结合，形成“气泡”。
气泡作为一种故障安全机制来检查靶DNA是否与crRNA匹配。如果它们正确匹配，则气泡扩大，并且其余的crRNA与其相应的靶DNA结合，形成所谓的“R-环”结构。
一旦R环结构完全形成，CRISPR级联复合体发生构象变化，将靶DNA锁定到位。它还在DNA的第二个非目标链上产生一个隆起，这是通过CRISPR级联复合体上的一个单独的位置实现的。
只有形成完整的R-环结构时，Cas3酶才可以在隆起处结合并切割DNA。
展望未来
未靶向DNA的CRISPR级联复合物的结构先前已经被解析，但该研究首次揭示了气泡形成到R-环形成的全部过程，并且分辨率达到了3.3A。
与手术刀般的Cas9相反，CRISPR-Cas3的作用就像一个切碎机。虽然目前CRISPR-Cas3作为一种精密基因编辑技术具有一定的局限性，但其正在被开发成为抵抗抗生素抗性菌株的工具。更好地了解其机制可能会扩大CRISPR-Cas3的潜在应用范围。
此外，所有CRISPR-Cas亚型都形成某些版本的R环来检测靶DNA以方便下一步切割。此过程中关键结构的解析为研究人员修改多种类型的CRISPR-Cas系统提供了知识理论，以提高CRISPR-Cas系统的准确性并减少生物医学应用中的脱靶效应。
参考文献：Ailong Ke et al. Structure Basis for Directional R-loop Formation
and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System. Cell,
June 2017 DOI: 10.1016/j.cell.2017.06.012
（转化医学网360zhyx.com）
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