循环肿瘤细胞检测对胃癌辅助诊断和预后的意义

乐飚¹, 宋毅¹，饶创宙²，钱海龙³，沈挺¹，张晓晶¹
1：宁波美晶医疗技术有限公司
2：宁波市第二医院放化疗科
3：宁波市李惠利东部医院胃肠外科

摘要：胃癌是中国继肺癌和肝癌之后的第三大常见肿瘤，年新确诊患者数量达30余万，约占全球患者总量的1/3，死亡率接近25/10万，占所有恶性肿瘤死亡率的23%。胃癌至今难以治愈，肿瘤的复发、转移是其致残、致死的主要原因。由于胃癌的早期诊断率低，临床确诊时接近40%的患者已失去手术机会，即使行根治术的患者，术后仍有将近80%会出现复发与转移。在这一过程中，外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cells ,CTCs)被认为扮演着不可或缺的重要角色。外周血循环肿瘤细胞被认为与恶性肿瘤的复发、转移密切相关，因其对肿瘤的早期诊断、临床分期、复发转移和耐药监测、预后判断、开发新的治疗靶点具有重要价值。美晶医疗与临床合作代表就目前CTCs检测技术在胃癌辅助诊疗和预后的意义进行归纳总结，以期为今后胃癌的复发转移和耐药监测、预后判断，治疗策略的及时调整，开发新的治疗靶点提供新的思路和重要依据。

肿瘤的复发，转移是一个多步骤、极其复杂的过程。经典的转移级联反应包括肿瘤局部侵袭性生长侵犯基底膜，肿瘤细胞从原发灶脱落，侵入邻近组织，肿瘤细胞内渗入血管和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞通过管道系统全身播散，从血管外渗，肿瘤细胞形成微转移，肿瘤细胞在远处器官明显生长形成明显转移灶[1-3]。循环肿瘤细胞是癌症研究和临床治疗史上划时代的成就，临床检测CTCs已成为检测各种治疗有效性的诊断工具。CTC检测在有效降低癌症诊疗成本的同时，针对癌症早期筛查和个性化医疗产生革命性的影响[4-10]。

循环肿瘤细胞 (Circulating tumor cells, CTCs) 是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。目前，CTCs检测技术主要分为物理学模式，正向/负向筛选模式或借助微流控芯片（CTC-Chip）。详见美晶医疗转化医学网4月刊的基于微芯片的自动化循环肿瘤细胞检测系统¾CellRichTM新型液体活检平台。宁波第七人民医院副院长兼外三科主任郝敬铎医师近日在宁波市惠民计划的赞助下，运用美晶医疗的CellRichTM新型液体活检平台对转移性结直肠癌患者实施CTCs检测时发现，在早期肿瘤患者中，利用影像学还未发现病灶时已经可以在外周血中检测到CTCs。研究表明，在疾病的早期，外周血循环肿瘤细胞对于良、恶性肿瘤的鉴别有一定的提示价值，也有助于转移风险的预测和判断；在疾病进展和治疗过程中，外周血循环肿瘤细胞能为动态检测病情、耐药性等临床诊疗的关键因素提供重要信息，有助于医师开展个性化的肿瘤治疗。

图1：胃炎（A）与胃癌（B）的症状区别（摘录自1999年中国实用外科杂志）

表1：胃癌患者TNM分期标准（摘录自2010年（国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会）UICCAJCC）

2008年，日本Keio大学医学院肿瘤外科的北川团队入组79位转移性胃癌，35位非转移性胃癌患者与健康人，实施CTC数量与临床病理学诊断的对比性研究。结果发现胃癌腹膜转移患者外周血中肿瘤细胞的数量（CTC数量》2个及以上）具有显著的统计学意义。文章发表在Ann Surg Oncol. 2008 Nov;15(11):3092-100[11]。此后北京大学附属肿瘤医院消化内科的沈琳教授在2016年CSCO会议上确认了这一现象，同年西班牙的医疗团队在结直肠癌腹膜转移患者中也发现了类似临床现象。

由于早期胃癌的诊断率低,多数患者在首诊时已经失去了手术机会,只能行姑息性治疗。宁波市第二医院放化疗科与李惠利东部医院胃肠外科对不能手术或不愿手术的局部进展期胃癌患者进行同步放化疗,并观察疗效和不良反应,取得了较好的效果。在疾病的诊疗过程中，外周血循环肿瘤细胞对于良、恶性肿瘤的鉴别有一定的提示价值；而对于恶性肿瘤则有助于转移风险的预测和判断。在疾病进展和治疗过程中，外周血循环肿瘤细胞能为动态检测病情、耐药性等临床诊疗的关键因素提供重要信息，有助于医师开展个体化的肿瘤治疗。

本文将从对胃癌的复发，转移发挥关键作用的循环肿瘤细胞(CTCs)进行概述。

1  循环肿瘤细胞对胃癌临床病理特点和预后意义的Meta分析

目前的研究发现循环肿瘤细胞与胃癌预后及临床病理特征有关,但是其研究结果尚有争议。2014年中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科的黄选章主任及其团队通过Pubmed和Embase数据库中检索关于循环肿瘤细胞在胃癌患者中的临床病理特点和预后意义的临床研究，提取26项临床研究共计2566名胃癌患者的相关临床指标及数据,使用随机效应模型对数据进行Meta分析[12]。分析结果都以相对应的效应量和95%可信区间表示。同时根据取样时间、取样位置和诊断方法的差异对研究进行深入的亚组分析。为判断合成结果的稳健性和可靠性进行敏感性分析。结果显示：相对于1期和2期胃癌患者,3期和4期胃癌患者中循环肿瘤细胞的发现率明显提高并且阳性率差异具有统计学意义(OR=0.36,95%CI[0.23,0.56],P<0.0001)。在胃癌组织学类型中发现循环肿瘤细胞的阳性率在Lauren弥散型和肠型患者之间具有统计学差异(OR=2.06,95%CI[1.06,4.00],P=0.03),循环肿瘤细胞的阳性率差异在淋巴管浸润(OR=2.92,95%CI[1.00,8.55],P=0.05)和血管浸润(OR=2.77,95%CI[1.90,4.05],P<0.00001)方面也具有相同的结果。对于胃癌患者预后而言,循环肿瘤细胞阳性患者的无病生存期短(HR=3.42,95%CI[2.39,4.91],P<0.00001),外周血中的肿瘤细胞能影响患者总生存时间(HR=2.13,95%CI[1.13,4.03],P=0.02)。

结论:循环肿瘤细胞能帮助预测胃癌患者预后结局,同时能在判断、评价胃癌临床病理分期起到重要作用。（文章载录于Int J Cancer. 2015 Jan 1;136(1):21-33）

2  胃癌患者循环肿瘤细胞的检测及临床意义

天津医科大学第二医院消化内科的张志广主任及其团队入组45例胃癌患者的外周血,应用密度梯度离心法和免疫荧光法检测外周血中的循环肿瘤细胞,并比较其临床病理意义（文章发表于2014年中国肿瘤临床杂志）。结果显示45例胃癌患者中27例为CTCs阳性, 阳性率为60%，与以往的文献报道一致。CTCs阳性率与淋巴结转移(P=0.007)、远处转移(P=0.035)和复发密切相关(P=0.035),而与胃癌患者的性别、年龄（≥60岁组和<60岁组）、肿瘤部位（近端组和远端组）、分化程度（低分化组和中高分化组）无关(P0.05)。在淋巴结转移组中CTCs阳性率（79.17%）较无转移组（38.10%）明显增高，在远处转移组中CTCs阳性率（78.95%）较无转移组（46.15%）亦明显增高，差异均有统计学意义。上述数据表明，胃癌中检测到CTCs可能是预测转移的指标之一。

表二：胃癌患者不同临床表征与CTCs阳性率的关联性（载录自2014年中国肿瘤临床杂志）

3  判断手术是否成功

ＣＴＣs的数量在血液中与肿瘤负荷成正比。在肿瘤手术切除之前，患者血液中的ＣＴＣs数量较高时，如果肿瘤切除手术成功，术后ＣＴＣs数量会大幅下降，如果手术不完全成功，术后ＣＴＣs数量仍保持较高水平，因此根据手术前后血液ＣＴＣs数量的变化，可对手术质量进行监测。

4  监测肿瘤转移复发风险

上海交大附属新华医院普外科的刘颖斌主任及其团队表示在恶性肿瘤病程中，由于肿瘤细胞本身的异质性基础及环境选择压力，可以造成肿瘤细胞基因状态的改变，比如出现新的点突变、拷贝数变异等，并且在位于原发病灶的肿瘤组织内的细胞和外周血循环肿瘤细胞之间，以及对于多发转移的肿瘤患者，在不同部位转移灶的细胞之间，往往也有着迥然不同的遗传背景和分子特质。当外周循环肿瘤细胞出现微转移灶定植后，由于其基因的不稳定性，容易发生基因突变，这些突变后肿瘤细胞，更容易入血形成新的CTCs，这其中蕴含着的关于肿瘤药物敏感性和病程进展的信息，在某种程度上，这对抗肿瘤治疗手段的选择和治疗策略的及时调整具有无可比拟的重要作用，对肿瘤的早期诊断、临床分期、复发转移和耐药监测、预后判断、开发新的治疗靶点具有重要价值[13]。

图2: Somatic alterations of ERBB3 and ERBB2 and their oncogenic effects on normal and GBC cells.（摘录自2014年Nature genetics）

5  抗癌靶向药物精准使用中的应用

在化疗过程中出现的抗药性一般与肿瘤的基因突变成正比。肿瘤的基因突变会存在于细胞的DNA中。通过检测CTCs中的DNA或直接检测血液中的游离DNA，可鉴定出现了哪些新的基因突变。且可根据突变的种类更换适应的靶向胡治疗药物，达到精准医疗的目的。

6  分析肿瘤异质性中的应用

肿瘤间异质性和肿瘤内异质性一直是困扰临床医师的难题。肿瘤间异质性是指两个同一种癌症患者的肿瘤组织内部分别含有不同的基因突变，肿瘤内异质性是指在一个肿瘤组织内部的不同区域含有不同的基因突变。组织活检很难判断肿瘤异质性，而由于ctDNA或CTCs是从肿瘤各个部分凋亡的肿瘤细胞产生的，因此涵盖各种突变，能全面反映肿瘤异质性。

7  CTC技术平台的国内外现状及展望

国外的CTC 检测公司大部分都有自己独立研发的检测平台或仪器，例如：Cynveniu 公司的ClearID 微流体平台，Fluxion Biosciences 公司的基于微流体技术以及免疫磁珠的IsoFlux 系统；ApoCell 公司的ApoStream®技术；Clearbridge Biomedics 公司的ClearCell® FX System；Creatv Microtech 公司的CellSieveTM 微型过滤器。国内的公司具有独立研发的CTC 检测仪器的公司并不多，宁波美晶医疗的CellRichTM循环肿瘤细胞捕获系统等等。（参照宁波美晶医疗官网：http://www.nanolitesystems.net）

宁波美晶医疗技术有限公司成立于2012年3月，公司拥有一支经验丰富、创新能力强的研发、生产管理和市场推广的人才队伍。公司主要开发“精准医疗”产品并提供相关服务。具体产品包括：

医疗器械方面：自主研发的“CellRich™”循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTC）检测系统及配套试剂，用于检测血液中的循环肿瘤细胞，进行诊断和监控癌症病情发展。该系统已有8项发明专利获得授权，20多项实用新型和软件著作权授权。项目填补了国内在CTC检测仪器方面的空白，获得了2014年“国家重点新产品”称号。作为同类别中的首创产品，美晶医疗也牵头制定了相关医疗器械分类标准（分类编码6841）。目前“CellRich™”系统已经在包括美国达特茅斯医学院及上海胸科医院在内的国内外多家知名医院投入使用。

检验服务方面：满足“精准医疗”对基因检测的需求，设立了美晶医学检验所，已获得卫生部颁发的医疗机构执业许可证书和临床PCR实验室资质。目前美晶医学检验所已开展临床细胞分子遗传学等检验服务，包括个性化用药基因检测，循环肿瘤细胞检测，疾病风险基因检测等多项业务。业务范围覆盖华东，华南地区，已在上海，杭州等地设立了区域营销中心。

液体活检与医学影像学诊断互补融合对于肿瘤精准诊疗具有重要临床意义， 随着液体活检技术的不断成熟，快速精确筛选和分析血液中完整的循环肿瘤细胞，由肿瘤细胞释放出的外泌体，和循环肿瘤DNA （ctDNA）等生物标记物，并与下游基因诊断相结合，将有力推动先进的分子诊断技术在个性化医疗中的应用。

1：Eccles SA, Welch DR.Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies。[J].Lancet 2007, 369(9574):1742-1757.

2：Gupta GP, Massague J. Cancer metastasis:  building a framework。[J]. Cell 2006, 127 (4):679-695.

3：Balic M, Dandachi N, Hofmann G, Samonigg H, Loibner H, Obwaller A, van der Kooi A, Tibbe AG, Doyle GV, Terstappen LW.Comparison of two methods for enumerating circulating tumor cells in carcinoma patients.[J].Cytometry Part B, Clinical cytometry 2005, 68(1):25-30.

4：Y. Zhu, K. Kekalo, C. NDong, Y. Huang, F. Shubitidze, K. Krisword, I. Baker andX.J. Zhang,Magnetic- nanoparticle-based immunoassays-on-Chip: materials synthesis, surface functionization and cancer cell screening. Advanced Functional Materials,2016

5: J. Wu, X. Wei, J. Gan, J. Lou, T. Shen, B. Liu,X.J. Zhang*, K. Qian*.  Multi-functional magnetic particles for combined circulating tumor cells isolation and cellular metabolism detection.Advanced Functional Materials (*co-corresponding authors), 2016

6: E. Ng, K. Chen, M. Hang, A. Syed,X.J. Zhang,Multi-dimensional nanostructure for microfluidic screening of biomarkers: from molecular separation to cancer cell detection.Annals of Biomedical Engineering, 1-16, 2015.

7: K. Hoshino, H. Chung, C. Wu, K. Rajendran, Y. Huang, P. Chen, K. Sokolov, J. Kim,X.J. Zhang,Immunofluorescence-assisted microfluidic single-cell quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analysis of tumor cells in blood.Journal of Circulating Biomarkers, Vol. 4:11, 2015. (the most popular research paper published in the journal for the year 2015)

8: P. Chen, Y. Huang, G. Bhave, K. Hoshino,X.J. Zhang,Inkjet-Print Micromagnet Array on Glass Slides for Immunomagnetic Enrichment of Circulating Tumor Cells.Annals of Biomedical Engineering, 1-11, 2015

9: Y.-Y. Huang, P. Chen, C.H. Wu, K. Hoshino, K. Sokolov, N. Lane, H. Liu, M. Huebschman, E. Frenkel,X.J. Zhang.Screening and Molecular Analysis of Single Circulating Tumor Cells Using Micromagnet Array.Scientific Reports, Nature Publishing Group, 5, 16047, 2015

10: P. Chen, Y-Y Huang, K. Hoshino andX.J. Zhang,Microscale Magnetic Field Modulation for Enhanced Capture and Distribution of Rare Circulating Tumor Cells.Scientific Reports, Nature Publishing Group, 5, 8745, doi:10.1038/srep08745, March, 2015

11：Hiraiwa K, Takeuchi H, Hasegawa H, Saikawa Y, Suda K, Ando T, Kumagai K, Irino T, Yoshikawa T, Matsuda S, Kitajima M, Kitagawa Y.Clinical significance of circulating tumor cells in blood from patients with gastrointestinal cancers.Ann Surg Oncol. 2008 Nov;15(11):3092-100.

12：Huang X, Gao P, Sun J, Chen X, Song Y, Zhao J, Xu H, Wang Z.Clinicopathological and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with gastric cancer: a meta-analysis.Int J Cancer. 2015 Jan 1;136(1):21-33.

13: Li M, Z Zhang, X Li, et al.Whole-exome and targeted gene sequencing of all gallbladder carcinoma identifies recurrent mutations in the ErbB pathway.[J]. Nature genetics.2014;46(8):872-876.

作者简介：

乐飚博士：宁波美晶医疗技术有限公司研发总监。日本名古屋大学工学博士，12年日本肿瘤临床与研究经历，擅长基于纳米技术的肿瘤早期诊断与治疗的放射性医药品研发及分子诊断，曾获得2001年度，日本生物工学学会第一届优秀论文奖等荣誉，入选2012年度上海市浦江人才，主持重大科研项目5项，参与或协助主持科研项目数十项，发表多篇SCI论文。

宋毅：宁波美晶医疗技术有限公司基因检测服务部经理。浙江师范大学理学硕士，7年的临床基因检测工作经验，目前主要带领部门开展相关临床检测服务，及开发CTC下游基因检测项目。

饶创宙：宁波市第二医院放化疗科主任医师，肿瘤学硕士，1998年毕业于浙江大学医学院后，一直从事肿瘤放化疗工作。目前为世界华人医师协会肿瘤放射治疗协作组（CRTOG）执行委员会委员，并兼任CRTOG肺癌专业委员会常务委员及食管癌专业委员会委员。同时任中国肿瘤防治联盟浙盟肺癌专业委员会副主任委员、浙江省抗癌协会肿瘤靶向与细胞治疗专业委员会常务委员兼青委副主委、浙江省医学会肿瘤学分会肿瘤精准治疗学组委员等等十余项学术兼职。主持包括吴阶平医学基金、宁波市科技局等多项课题，多篇SCI论文发表。2次获宁波市岗位建功立业三等功。·

钱海龙：宁波市李惠利东部医院胃肠外科副主任医师，外科学硕士，1998年毕业于第二军医大学海军临床医学系，长海医院普外研究生，长期从事胃肠外科临床、科研工作。浙江省抗癌协会胃肠道间质瘤专业委员会委员，宁波市胃肠道间质瘤专科门诊负责人，系中国癌症基金会（索坦）、中华慈善总会（格列卫）项目注册医师。

沈挺博士：宁波美晶医疗技术有限公司总经理，入选浙江省“千人计划”。 作为主要项目及团队负责人开发的“新一代癌症血液检测生物芯片及系统”项目，获得了中国科技创业计划大赛项目组一等奖，中国首届创新创业大赛优秀企业奖，宁波市首批市“3315计划”海外高端创业创新团队最高奖A类，宁波市发明创新大赛奖，及国家科技部中小企业技术创新基金的立项。本科毕业于清华大学自动化系，2004年获美国斯坦福大学 (Stanford University)管理科学与工程博士学位。具备丰富的工程技术研究，高新技术产业化和国际化企业管理的经验与背景。善于团结带领团队，整合资源，带领公司不断创新，开拓业务。

张晓晶博士：宁波美晶医疗技术有限公司董事长。入选国家第二批“万人计划” 科技创新领军人才，科技部中青年科技创新领军人才，浙江省“千人计划”，美国医学和生物工程研究院院士（AIBME Fellow），获得美国国立卫生院（NIH）院长创新研究奖。毕业于美国斯坦福大学，回国创业前任美国著名常春藤盟校(Ivy League)之一的达特茅斯学院(Dartmouth College)正教授， 任生物医学微纳米型器件实验室主任。学术休假期间，曾任美国美国斯坦福大学访问教授，上海交通大学 “王宽诚”讲席教授。

（转化医学网360zhyx.com）