3min 400种代谢物LC-MS/MS分析方法有效提高代谢组研究通量

本期小编给大家带来一篇文章分享，来自于科罗拉多大学丹佛分校Angelo D'Alessandro教授课题组2017年发表在Rapid Communication in Mass Spectrometry上的一篇文章，题为A three-minute method for high-throughput quantitative metabolomics and quantitative tracing experiments of central carbon and nitrogen pathways。

在精准医学所依赖的大规模队列研究中， 实验通量和数据重现性是最为重要的考量指标。Angelo D'Alessandro教授课题组基于Vanquish-Q Exactive 技术建立了3min方法测定400多种代谢物的方法，覆盖到糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、鸟氨酸循环、氨基酸代谢途径、嘌呤代谢及其嘧啶代谢等多种和癌症相关性较强的代谢途径，且适用于体液、血浆、组织、细胞等复杂基质，极大的提高了复杂基质中代谢物研究通量，并实际应用于潜在标记物发现、代谢流分析、发病机理研究等领域，助力于精准医学研究、转化医学及其临床代谢组研究工作。

UHPLC-MS方法建立

该方法基于Vanquish UHPLC系统和Q Exactive超高分辨质谱，使用Kinetex C18（2.1mm x 150mm,1.7?m）反向色谱柱，0.25mL/min流速下，柱温25℃，乙腈：水5:95-0.1%甲酸体系下等度洗脱。Orbitrap质谱采用70,000分辨率下一级全扫模式（60~900m/z）分别进行正离子及其负离子扫描。

UHPLC-MS方法选择性验证

作者从分离能力上着重考察了方法的选择性，对于糖酵解途径、三羧酸循环、谷氨酰胺异化、多胺代谢等主要代谢途径的化合物具有较好的分离能力，如图1所示：

图1：不同极性化合物分离色谱图

并对代谢物中的同分异构体可实现基线分离，如亮氨酸和异亮氨酸，延胡索酸和马来酸，柠檬酸和异柠檬酸，下图是2,3-cAMP和3,5-cAMP提取一级色谱图分离情况如图2：

图2：2,3-cAMP和3,5-cAMP提取离子流图

UHPLC-MS方法重复性

在所建立的方法条件下，作者使用复杂基质样品考察方法重复性。6天连续运行1200个样品测试，每隔15次进样穿插QC样品考察方法保留时间、峰面积、质量精确度重复性，以谷谷胱甘肽为例重复性如图3所示：

1）峰面积变异系数为2.7%；

2）保留时间变异系数为0.28%；

3）精确质量数均保持在5ppm内；

4）13C1同位素峰M+1相对强度平均偏差小于0.5%：

图3：谷胱甘肽峰面积、质量精确度、同位素峰相对强度重复性测试

绝对定量能力验证

基于所建立方法，考察了外标法及其同位素内标法线性范围及其定量准确性：

1） 外标法定量：

作者测试了碳途径和氮途径中的重点代谢物线性相关系数及其灵敏度，线性相关系数均大于0.98，线性范围均达四个数量级，检出限在100 fmol；

图4：代谢物线性关系

2） 内标法定量：作者以同位素内标13C5-Glucose加入到复杂基质中定量样品中Glucose的含量，在线性范围0.1~1000?mol,13C5-Glucose线性相关系数大于0.998，不同天测定线性方程接近；

3） 离子抑制效应考察：作者对加入内标的基质样品进行1倍稀释，分别定量稀释前后样品中Glucose浓度，定量浓度和稀释倍数对等，并对其他代谢物采用同样方式进行离子抑制效应考察，结果如图5所示。

图5：内标法定量结果

UHPLC-MS方法应用于创伤性型小鼠

与代谢物关系分析

作者通过对创伤性小鼠的淋巴液、支气管肺泡灌洗液、血浆的研究，发现创伤性小鼠体液中琥珀酸具有明显的差异性。为了验证琥珀酸的来源，作者对小鼠创伤性和正常小鼠同时进行13C515N2-glutamine  静脉注射，基于建立的UHPLC-MS方法追踪受伤小鼠和正常小鼠肺中具有同位素标记的琥珀酸含量，如图6所示，发现同位素标记代谢物谷氨酰胺、琥珀酸具有在创伤性小鼠体内具有明显的上调趋势，这应该是谷氨酰胺通过谷氨酰胺分解途径产生的谷氨酰胺进入TCA代谢途径，促进琥珀酸的积聚，验证了作者提出的受伤小鼠会促进琥珀酸累计，谷氨酰胺代谢途径中的一些酶可能对于小鼠因创伤性休克起着重要的修复作用的假设。

图6：创伤性小鼠肺中代谢物研究

图7：谷氨酰胺分解

小 结

本文基于Vanquish UHPLC和超高分辨质谱Q Exactive系统，建立了在3min时间内适用于不同复杂基质中400多种代谢物测定高通量方法，可准确测定糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、鸟氨酸循环、氨基酸代谢途径、嘌呤代谢及其嘧啶代谢等重要代谢途径中代谢物，具有较好的保留时间、质量精确度、峰面积重复性及其稳定性，且适用于血浆、体液、微生物、组织等多种复杂基质。与常规方法相比，大大提高了代谢物测定通量，有效助力精准医学、转化医学及其临床研究对于高通量的需求。

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