中国科学家取得重大突破，世界首例SCNT克隆短尾猴诞生！

自1996年克隆羊多莉诞生以来，克隆技术一直是社会关注的重点。尤其是灵长类的克隆技术，这对于人类的自我研究起到了至关重要的作用，但是这项技术也异常的难实现。《Science》在2003年更是发表了一篇美国匹兹堡大学医学院的论文，称用现有技术克隆灵长类动物是行不通的。

7年后，也就是2010年，美国俄勒冈灵长类研究中心的著名科学家米塔利波夫率领团队成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎发育至81天就以流产告终。

图丨由中国科学家创造的SCNT克隆短尾母猴“中中”和“华华”

然而这项“行不通”的技术却被中科院上海神经科学研究所孙强、蒲慕明领导的研究团队打破了，该团队于2017年11月27日利用体细胞核移植技术（SCNT），创造了短尾猴“中中”，并于10天后创造了短尾猴“华华”。至此，世界上首只体细胞克隆猴诞生了，而这项研究则在2018年1月25日登上了《Cell》期刊。

如何创造克隆猴？

体细胞克隆猴有三大技术难点：细胞核不易识别，“去核”难度大；卵细胞容易提前激活；体细胞克隆胚胎的发育效率低。

于是该团队首先优化了SCNT方案，包括从卵母细胞中去除纺锤体。致使胎儿猴的成纤维细胞与去核卵母细胞融合后检测到明显的纺锤样结构。融合后约1 - 2小时，用离子霉素和6-二甲基氨基嘌呤（I/D）活化重建卵母细胞。所有活化的胚胎显示单原核。

进一步将I/D激活的SCNT胚胎的一小部分（13.8％）发育至胚泡阶段。在I/D激活组之后，为了提高SCNT胚胎的发育潜力，该团队还花费了10个小时的时间，用10纳米蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）来制作了另一组SCNT胚胎（I/D/T）。

这样的做法虽然不能提高囊胚率（16.7％），但是囊胚的质量得到了改善。在I/D激活组中，内细胞团（ICM）很少，甚至没有。然而在I/D/T组中，其2/5的囊胚中都能观察到明显的ICM。

图丨将核供体细胞与血凝素病毒分离出的病毒包膜共同孵育，并促进供体细胞插入透明带的激光损伤的卵周隙

随后，研究团队将外源性人类Kdm4d mRNA注射到I/D/T激活的SCNT胚胎中，大约45%的胎儿猴成纤维细胞能够发育成囊胚。而剩下的那些胚胎，则表现出类似于向囊胚内注射精子后所获得的ICM。

研究团队还测试了Kdm4d mRNA对来自成年雌性猴子卵母细胞SCNT胚胎的作用，并且发现在I/D/T条件下所有SCNT胚胎在激活后都显示出单个原核。同时大部分能够发育成囊胚。且均能观察到明显的ICM。相反，在没有Kdm4d mRNA注射的情况下，只有5％的SCNT胚胎（来自卵母细胞）能够发育成胚泡，而且没一个有明显的ICM。

为了进一步了解Kdm4d mRNA对改善猴SCNT胚胎发育的影响，研究团队通过ICSI技术从卵母细胞中获得了4-细胞胚胎、注射了Kdm4d mRNA的8-细胞胚胎，以及没有注射Kdm4d mRNA的8-细胞胚胎，并对三者进行了RNA测序。

其结果是，8-细胞胚胎和4-细胞胚胎在3997个区域中，前者的表达量高了后者四倍，而注射过Kdm4d mRNA的细胞胚胎的RRR为2178，没注射过的为2465。通过H3K9me3的免疫染色进一步证实了Kdm4d mRNA表达在去除SCNT胚胎的组蛋白甲基化位点H3K9me3中的作用：SCNT胚胎中H3K9me3的水平高，注射Kdm4d mRNA后就会降低。

图丨简化版

两组实验取得了不同的结果：在第一组实验中，21只代孕母猴中的6只成功怀孕，最终生下了2只健康的猴子，它们就是“中中”和“华华”；另一组研究，42只代孕母猴中有22只成功怀孕，最后也有两只猴子出生，然而它们短暂存活后死亡。

研究的意义

这项克隆猴技术的研究简单点来说就是使用胎儿成纤维细胞的体细胞核转移（SCNT）克隆两只猴子，但是其科学意义远不止于此。

图丨科幻作品中的克隆人

首先，研究揭示了遗传调节剂对SCNT胚胎的发育和妊娠率的影响。H3K9me3去甲基化酶Kdm4d mRNA的注射和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A在SCNT后一个细胞阶段的处理极大地提高了SCNT胚胎的囊胚发育和妊娠率。

其次是用卵母细胞创造SCNT克隆猴来推翻此前“行不通”的言论。卵母细胞是核供体细胞重编程的场所，为克隆胚胎发育提供了充足的物质基础，它的来源以及成熟质量直接影响到克隆效率的高低。

近年来，为提高卵母细胞与克隆胚胎的质量，研究人员进行了大量的尝试。有研究表明，在克隆猪胚胎的培养中添加一定剂量的维生素C 可以显著提高克隆胚的质量，一些干细胞因子（Oct4、Klfl4、Sox2）的mRNA表达量明显上升，其表达量可达到 IVF胚胎水平，使用维他命C处理过的胚胎进行胚移后，其产仔率明显升高。使用CBHA（一种去组蛋白乙酰化抑制剂）处理小鼠的克隆胚胎后，胚胎克隆效率明显提高，并且还源于克隆胚胎的干细胞质量也明显提升。因此，克隆猴研究的结果，也延伸了克隆技术中卵母细胞的应用。

图丨由假说到落地，克隆绵羊多莉的诞生

其三则是证实了SCNT猴的克隆起源假说。

对SCNT的意义更重大

虽然这是人类首次克隆非人类的灵长类动物，但是SCNT技术早在1997年就已经实现了动物的克隆（多莉）。目前来看，该技术更多的被应用于牦牛、种猪等功能性家畜的培育，因为这类家畜在种群中出现的几率极低，所以光靠人工培养是远不能满足需求的。

图丨简易版SCNT

不过该领域并没有成熟的SCNT技术落地，仍停留在理论阶段。湖北省农业科学院畜牧兽医研究所曾于2017年发表了一篇论文，解释了从受体卵细胞的准备、供体细胞的选择到核移植技术、重构胚胎等几大SCNT培育种猪的步骤。然而论文结尾处作者表示对该技术并不乐观，因为其克隆效率低、克隆动物细胞存在突变可能等。

事实上孙强、蒲慕明的研究也不能完全改善这一现状，但是这项研究给了SCNT另一种扩展思路：顽疾研究。单论灵长类这一点，人类与猴子在某种程度上是亲戚。所以，克隆猴技术的诞生，变相地打开了一条阿尔茨海默症、自闭症等脑疾病以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病治疗方法的研究之路。

图丨克隆猴Tetra

2000年，俄勒冈灵长类动物研究中心利用胚胎分裂法（embryo splitting）克隆了猕猴Tetra。这种克隆方法不同于SCNT，而是把多个猴胚胎（107个）进行分裂，然后对胚胎进行移植。结果有4个能够发育，最终仅有一只名为Tetra在胚胎分裂157天之后幸运地降生。不过这项技术的难度没法和SCNT比较，因此该研究成果并没有获得科学界的广泛关注。

SCNT还需要解决哪些问题？

接着DT君在上文提到的体细胞克隆成功率问题继续说，目前公认的体细胞克隆成功率在1%～3%。克隆胚胎移植后的出生率平均不10%。表观遗传修饰异常应该是体细胞核转移后供体细胞核在细胞质中可逆分化效率低的原因之一。胎儿异常、流产和围产期死亡率高，出生后一周的死亡率最高可达100%。

其次，无论直接注射还是细胞融合，供体核都带入一部分细胞质。于是，就出现了移核胚胎的线粒体来源问题。多莉和另外9只经细胞融合产生的克隆绵羊的mtDNA 完全来源于受体胞质。Meirelles证明，瘤牛（Bos indicus）克隆后代的线粒体完全来源于黄牛（Bos taurus）卵母细胞质。但Steinborn等却发现，克隆牛的线粒体为杂合型，既有来自于供核细胞的，也有来自于受体胞质的。因此，核移植克隆动物实际上是一种遗传嵌合体-nDNA 来源于核供体细胞，而mtDNA则至少部分来自受体胞质。

图丨克隆羊

其三，端粒是染色体端部特化部分，因无黏性而能防止染色体黏着。端粒由高度重复的短序列核苷酸组成，具有高度保守性。细胞每复制一次端粒核苷酸就减少50～100bp。端粒复制要靠端粒酶。正常细胞缺乏此酶，故端粒随细胞分裂而变短，细胞衰老。而生殖细胞和癌细胞则都有此酶，因此不衰老。以多莉为例，它的端粒限制性片段平均长度（mean Terminal Restriction Fragment，TRF）都比同龄对照羊短。

其四，雌、雄哺乳动物的基因剂量补偿是通过灭活雌性动物的一条X染色体来实现。正常情况下，着床前胚胎的两条X染色体都活动。后来，上胚层中 X 染色体随机灭活，而滋养层细胞则专门灭活父系X染色体。小鼠克隆胚胎胚体的X染色体灭活方式是随机的；即体细胞中活动X染色体Xa与灭活X染色体Xi之间不同的标志在核移植后被擦除了，重新发生随机灭活。但克隆胚的滋养层则保留了原有体细胞的X染色体灭活状态。然而，死亡克隆牛X-连锁基因在同一器官中有的表达，有的不表达，说明X染色体灭活不完全。死亡克隆胎盘X染色体随机灭活，但活克隆为父亲X染色体灭活。

图丨科幻影视作品中的克隆人

最后就是克隆胚胎某些基因的再程序化异常。目前已有试验证明，受精后父系和母系基因组都发生广泛的去甲基化。牛正常胚胎在8-细胞前，甲基化程度进一步下降，到16-细胞时又开始再甲基化。克隆1-细胞胚胎的甲基化程度下降，但以后并不进一步去甲基化，而是提前发生再甲基化。克隆桑椹胚所有卵裂球的核都高度甲基化，类似于供核胎儿成纤维细胞。经过咖啡因或钒酸盐处理的核能够影响核转移的发展和甲基化程度。还有人证明，牛着床前移核胚胎中有些重复序列的甲基化异常，某些胚胎基因往往不能再激活。这说明，大多数克隆胚胎的后成性再程序化异常，不彻底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因。

SCNT技术从20世纪发展至今还有许多问题没有解决，然而这并不奇怪。孙强和蒲慕明通过试验解决了1到0的问题，同时他们也打开了通往1到无限的门。剩下的就是拉力赛了，正如《我的滑板鞋》中的歌词一样，“时间会给你答案”。（转化医学网360zhyx.com）

参考：

1.Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer, Zhen Liu, Yijun Cai, Yan Wang, Yanhong Nie, Chenchen Zhang, Yuting Xu, Xiaotong Zhang, Yong Lu, Zhanyang Wang, Muming Poo, Qiang Sun

2.体细胞核移植技术的研究进展，王巍，付茂忠，唐慧，甘佳，方东辉，王淮，易君

3.BriggsRKing， TJProc.Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’eggs［J］.Natl Acad Sc

4. McGrath J，Solter D. Structure and organization of the human Ki-ras proto-oncogeneandarelatedprocessedpseudogene