Cell丨曹雪涛组阐明新型长非编码RNA介导固有免疫的反馈调节机制——徐平龙、侯法建点评

宿主的固有免疫系统通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）感应入侵病原体激活免疫应答从而达到清除病原体的目的。针对于RNA病毒的入侵，RIG-I（retinoic acid-inducible gene-I）受体识别胞质病毒RNA并产生I型干扰素（type I interferons ，IFNs）及细胞因子【1,2】。然而，IFN的过度表达则会引发机体自身免疫性疾病的产生，因此，IFN的表达平衡调控是免疫学家关注的研究重点之一。

RIG-I的分子结构包含N端CARDs（caspase activation and recruitment domains， CARDs）结构域，DECH解旋酶结构域与C端CTD（C-terminal domain，CTD）结构域。静息态的RIG-I分子以自身抑制状态存在，其中CARD2结构域结合于解旋酶结构域的插入区；而当病毒的5’三磷酸双链RNA入侵后，CTD结构域感应并结合RNA，使得RIG-I分子转变为开放构象释放CARDs结构域，介导下游信号传递与免疫应答【3】。因此，携带5’三磷酸的双链RNA是激活RIG-I的要素之一【4】，然而RIG-1是否可以结合宿主自身RNA及其功能的研究目前处于空白状态。

近年来，长非编码RNA（long noncoding RNAs ，lncRNAs）通过与特定蛋白发生相互作用而参与众多生理病理过程的研究愈发引人注目。利用紫外交联免疫共沉淀测序技术（high-throughput sequencing of immunoprecipitated RNAs after cross-linking，CLIP-seq）在人与小鼠中分别鉴定到21073与1662组RNA结合蛋白（RNA-binding protein ，RBP）- lncRNA互作关系【5】。然而，RBP-lncRNA互作关系在免疫与炎症中发挥的作用目前尚未有研究报道。2014年，曹雪涛团队在Science发表研究论文，报道了长非编码RNA–lnc-DC通过与转录因子STAT3相互作用促进其磷酸化从而调控人类树突细胞分化的过程，拓宽了研究人员对lncRNA参与免疫细胞分化及功能的认知【6】。

4月26日，中国工程院院士、南开大学校长曹雪涛所率领的团队在Cell杂志在线发表了题为 Self-Recognition of an Inducible Host lncRNA by RIG-I Feedback Restricts Innate Immune Response 的研究论文，发现了一种起源于宿主自身的，IFN诱导的新型长非编码RNA-lnc-Lsm3b，lnc-Lsm3b可与病毒RNA竞争性结合RIG-I单体，在免疫应答晚期发挥负反馈调节作用，抑制RIG-I的活性。机制上来说，lnc-Lsm3b通过其多价的长茎结构域结合RIG-I并阻止了其构象变化从而抑制了下游信号传递。BioArt还特别邀请了从事相关研究的两位专家对上述工作进行精彩点评，以飨读者！

在这项研究中，研究人员首先利用紫外交联免疫共沉淀技术（UV cross-linking and RNA immunoprecipitation assay，UV-RIP）鉴定到了胞质lnc-Lsm3b，lnc-Lsm3b作为Lsm3基因编码的唯一成熟性lncRNA，在RNA病毒感染宿主时表达显著升高且可与RIG-I发生结合，同时IFN也可诱导lnc-Lsm3b的表达。随后，lnc-Lsm3b在RNA病毒感染的巨噬细胞内可抑制RIG-I介导的免疫应答，阻抑IFN与抗炎因子的产生。与其他负调控因子在RIG-I信号通路早期发挥作用不同的是，lnc-Lsm3b阻止RIG-I引发的IFN的表达主要发生与抗病毒应答晚期。进一步地，研究人员在lnc-Lsm3b-/-敲除的小鼠中观察到RNA病毒感染后，lnc-Lsm3b-/-敲除小鼠体内的IFN在18-24小时的表达显著升高，且病毒滴度显著减少，证明了lnc-Lsm3b主要在抗病毒信号级联反应晚期有效抑制RIG-I的功能。

Lnc-Lsm3b参与RIG-I抗病毒信号通路主要是通过与RIG-I的CTD结构域发生相互作用，且lnc-Lsm3b与RIG-I的结合可以有效抑制病毒RNA-5’三磷酸双链RNA结合RIG-I的CTD结构域。因此，RIG-I的CTD结构域作为两种RNA重叠性结合区域可为两者的竞争性结合提供分子基础。机制上看，lnc-Lsm3b所拥有的多分支环状结构为其与病毒RNA竞争性结合RIG-I提供结合条件。对于RIG-I的结合，Lnc-Lsm3b相比于病毒dsRNA拥有更高的亲和效率，因此可以结合细胞内新合成的大部分RIG-I单体分子从而抑制信号的传递。

此外，研究人员探究发现，宿主自身对于lnc-Lsm3b的识别可以帮助RIG-I处于非激活状态。lnc-Lsm3b通过稳定RIG-I分子内CARDs结构域与解旋酶结构域的相互作用，使得RIG-I分子在病毒刺激时处于自身抑制的结构，干扰了CARDs结构域与MAVS分子的相互作用。同时，在RNA病毒刺激中，由TRIM25介导的RIG-I K63泛素化在lnc-Lsm3b的作用下也受到抑制。因此，研究人员证实了宿主自身的lnc-Lsm3b是RNA病毒感染时RIG-I信号通路的强力负调因子。

总的来说，该研究的亮点在于不仅发现了一类新型的长非编码RNA-lnc-Lsm3b并阐明了其抑制免疫反应过度激活的机制，为人体lncRNA与免疫分子的相互作用提供了研究思路，也为自身免疫性疾病的治疗与预后奠定了研究基础。

专家点评

徐平龙（浙江大学生命科学研究院教授，国家杰青）

Comments：核酸固有免疫识别机制及其诱导的干扰素（IFNs）以及后续的干扰素诱导基因（ISGs）的表达组成了脊椎动物重要的宿主防御系统，在抵抗病原微生物尤其是病毒感染中起关键作用。过度激活的核酸免疫识别则诱导细胞死亡、衰老以及炎症、自身免疫等多种严重疾病。因此，宿主细胞对此“危险识别”系统有极为繁复的调控和保险机制，比如陈志坚实验室2015年在Science报道的TBK1对其上游接头蛋白MAVS、STING及TRIF的“逆向”识别与修饰，从而以信号的来源来决定信号的强度和广度。但是，学界对核酸免疫识别信号的终止机制目前还所知相对甚少。

曹雪涛院士是核酸固有免疫识别调控机制的主要开拓者之一，尤其在鉴定该系统的表观遗传调控及蛋白修饰调控方面做出了一系列卓有成效的工作。曹雪涛院士最新发表在Cell的研究，以识别细胞质中异源RNA的受体蛋白RIG-I为对象，鉴定了干扰素诱导基因（ISGs）之一的长联非编码RNA lnc-Lsm3b是核酸免疫识别的重要调控元件。Lnc-Lsm3b能够通过自我识别机制，利用其长茎及多枝环状的特殊结构，作为诱饵富集多个RIG-I并限制其CARD结构域的开放，从而竞争性地抑制RIG-I对病毒RNA的识别，构成了核酸免疫识别机制后期的负反馈调控。这项工作不仅首次鉴定了lncRNA是核酸固有免疫识别及炎症调控的重要调控元件，也揭示了lncRNA在哺乳动物抗病毒中的关键功能，因此是核酸免疫识别调控以及lncRNA功能研究观念上的重要突破。这项工作同时也进一步证实了RIG-I这一重要“异源”RNA受体也能够有效识别并结合宿主细胞“自身”RNA，验证了长期以来领域内的猜测。工作深化了我们对RIG-I这一关键RNA识别受体调控复杂性的认识，也提出了通过调节lncRNA进行抗病毒或抗炎症治疗的创新思路。

由于lncRNA普遍的低丰度，其是否具有实质功能在业界仍然有非常大的争论。曹雪涛院士的工作表明细胞内生成的约250个拷贝的lnc-Lsm3b，通过其“一对多”的结合特性，能够富集宿主细胞内所有新诱导生成的RIG-I。这一有力证据从而给lncRNA的功能研究提供了重要启示。

侯法建（中科院上海生化细胞所PI，青年千人）

Comments：干扰素信号通路在宿主细胞防御病毒侵染中发挥重要作用，其中RIG-I是定位于细胞质中的模式识别受体，RIG-I结合病毒相关的RNA后激活下游信号通路、诱导干扰素的表达。干扰素通过诱导几百个基因（ISG）的表达从而发挥抗病毒功能，RIG-I也是ISG之一。以前人们猜测，RIG-I在病毒感染后期的上调表达可能会进一步放大抗病毒天然免疫反应，以彻底抑制病毒侵染。另一方面，过度的天然免疫反应可能导致过度炎症以及相关疾病，因此，近年大量的研究工作关注对RIG-I信号通路的下调。曹老师的工作（Cell, 2018）发现了一个新的ISG，即长非编码RNA lnc-Lsm3b，能够抑制RIG-I的激活。

以前的结构生物学研究表明，RIG-I的N端结构域CARD与中间的解旋酶结构域以及C端结构域CTD相互作用，处于非活性的“封闭”状态；RIG-I结合病毒RNA以后，释放其N端的CARD结构域，从非活性的“封闭”状态转变为活性的“开放”状态；而lnc-Lsm3b能够稳定CARD与解旋酶结构域以及CTD结构域的相互作用，从而阻止其激活，表明相对于病毒RNA，RIG-I对lnc-Lsm3b具有更高的亲和力。这项研究解释了在病毒感染后期RIG-I作为ISG而不能诱导产生更多干扰素的现象。这是曹老师实验室继前期发现Siglec-G降解RIG-I后（Cell, 2013），在RIG-I信号通路负调节领域的又一力作。

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参考文献

1.Takeuchi, O., and Akira, S. (2010). Pattern recognition receptors and inflammation.Cell 140, 805–820.

2. Hajishengallis, G., and Lambris, J.D. (2011). Microbial manipulation of receptor crosstalk in innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 187–200.

3. Kowalinski, E., Lunardi, T., McCarthy, A.A., Louber, J., Brunel, J., Grigorov, B.,Gerlier, D., and Cusack, S. (2011). Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell 147, 423–435.

4. Hornung, V., Ellegast, J., Kim, S., Brzo´ zka, K., Jung, A., Kato, H., Poeck, H.,Akira, S., Conzelmann, K.K., Schlee, M., et al. (2006). 50-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science 314, 994–997.

5. Li, J.H., Liu, S., Zheng, L.L., Wu, J., Sun, W.J., Wang, Z.L., Zhou, H., Qu, L.H.,and Yang, J.H. (2015). Discovery of protein-lncRNA interactions by integratinglarge-scale CLIP-Seq and RNA-Seq datasets. Front. Bioeng. Biotechnol. 2, 88.

6. Wang, P., Xue, Y., Han, Y., Lin, L., Wu, C., Xu, S., Jiang, Z., Xu, J., Liu, Q., and Cao, X. (2014). The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation. Science 344, 310–313.

（转化医学网360zhyx.com）