经5年攻关,朱健康研究组在CRISPR领域取得重大进展,将在CRISPR掀起一场革命(附2018年朱健康研究组发表的所有的文章)

iNature：2018年5月17日，朱健康研究组在Nature Communications在线发表了题为“CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in Arabidopsis using sequential transformation”的研究论文，该论文报道了拟南芥中基因靶向的连续转化-精确基因靶向方法。使用来自卵细胞和早期胚胎特异性DD45基因启动子驱动Cas9， 通过同源重组在几个内源性位点上定向插入标签或者是进行氨基酸替换， 这些可遗传的基因靶向可通过常规PCR鉴定。 该方法可以对拟南芥基因组进行常规和精细操作。这对于后期的定点突变，插入特定的标签，插入长片段的TE等操作具有非常重大的应用意义，这极大的推动了植物基因编辑领域，对于进一步农业上的遗传育种做了很好的铺垫。同时iPlants编辑组盘点了朱健康组在2018年发表的文章，希望对你有用，共6篇。

精确的基因组修饰，例如通过同源重组进行DNA敲入和基因置换（即基因靶向）是一种功能强大的工具，广泛应用于包括果蝇和动物在内的许多生物体的研究。然而，由于同源重组效率低，基因打靶（GT）在高等植物物种中仍然是非常具有挑战性的。

已经使用工程序列特异性核酸酶例如锌指核酸酶（ZFN），转录激活剂样效应子核酸酶（TALEN）和成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（Cas9）来产生位点特异性双链断裂（DSBs）在许多生物体中进行基因组编辑。通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复这些DSB导致随机突变，而无差异同源性定向修复（HDR）在提供同源DNA底物时产生精确的序列变化。基因组编辑的目标是实现可遗传的GT，其定义为在生殖细胞中任何感兴趣的基因组位点处精确插入或置换序列。

然而，HDR介导的内源基因GT在高等植物中效率极低，阻碍了其广泛应用。植物中的第一个GT在烟草中的卡那霉素抗性基因中得到证明，效率范围从10-6到10-3。后来在水稻中开发了一种利用正负选择的高效方法;然而，这种复杂的策略仅用于修饰水稻中的几个基因，并未成功应用于其他植物，包括拟南芥和烟草。序列特异性核酸酶可以提高GT的效率，并且CRISPR / Cas9辅助的HDR已经用于包括人类干细胞在内的各种模型系统中的GT。 尽管如此，这些GT事件主要依靠选择目标基因座上的抗生素或除草剂抗性基因来提高效率。少数不依赖选择标记的GT事件显示极低的频率，因此限制了这些方法的有用性。

在这里，朱健康研究组描述了拟南芥中无缝GT的简单方法，包括框内基因敲入和氨基酸替换。通过在拟南芥中靶向内源DNA糖基化酶基因ROS1和DME来证明该方法的实用性。对于该文章，朱健康及Miki Daisuki共同通讯，张文心及Miki Daisuki共同一作，该工作得到中科院的相关经费资助。

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1.水稻基因组中精确的A·T到G·C碱基编辑

朱健康研究组成功开发了水稻中的腺嘌呤碱基编辑器，从而拓宽了植物中的基因组工程工具。 这里描述的腺嘌呤碱基编辑器以可编程的方式有效地和特异性地将目标A·T转换成G·C。 重要的是，朱健康研究组没有在目标位点或潜在的脱序位点上发现任何插入缺失或其他碱基转换或颠换突变。 这些特征使腺嘌呤碱基编辑优于胞苷脱氨酶介导的C-T编辑和HDR介导的序列替换。 此外，朱健康研究组证明了腺嘌呤碱基编辑器可用于高效率的多重碱基编辑。 因此，将来可以同时编辑控制不同农艺性状的多个基因。 综合起来，这里描述的腺嘌呤碱基编辑器与其他基因组工程工具一起将有助于推进作物的精确分子育种。

2.朱健康研究组在表观领域取得重大突破（点击阅读）

该篇文章揭示了DNA甲基化（epiallele）参与影响自然界植物叶片的衰老关系。这也是为数不多的DNA甲基化影响植物表型的例子，同时也是表观遗传参与全球气候变暖过程很好的证明。无论大到整个高等植物或者哺乳动物，还是小到拟南芥或者人类，生命体之间都表现出极度的多样性。高度的多样性令人困惑，但又是一个具有非凡魅力的科学问题。达尔文的进化论合理的解释了生命的多样性。多样性为种群适应复杂多变的环境提供了坚实的基础。现代遗传学揭示DNA序列的变异是同一物种表型多样性的基础。但是，关于表观遗传学在这些过程的作用的研究是有限的。

3.水稻microRNA166的敲除赋予水稻抗旱性

MicroRNA是19-22nt小的非编码RNA，并且涉及非生物应激反应。在这项研究中，朱健康研究组发现操纵microRNA166导致形态变化，赋予水稻抗旱性。从对水稻中miRNA敲低系的大规模筛选中，朱健康研究组鉴定了表现出miR166敲低品系（STTM166）。 STTM166水稻植株的叶片卷曲可能是由于大小减少的红色细胞和叶片中的叶状细胞的异常。 STTM166植物的气孔导度降低，蒸腾速率下降。分子分析揭示了HD-Zip III基因家族的成员OsHB4作为miR166的主要靶标。 miR166-OsHB4的下游基因由可能有助于细胞壁形成和脉管发育的多糖合成相关基因组成。朱健康研究组的研究结果表明，通过操纵miRNAs可以增加水稻的抗旱性。

4.朱健康等研究组揭示植物生长与胁迫之间的平衡机制（点击阅读）

作为不能移动的植物，它必须适应环境的变化。环境胁迫引发各种反应，包括由植物激素脱落酸（ABA）介导的生长抑制。将压力反应与生长相结合的机制知之甚少。在这里，朱健康及熊延研究组合作发现雷帕霉素激酶的靶标（TOR）磷酸化 ABA受体PYL，以防止在无应激的状态下，植物被过度激活。这种磷酸化破坏了PYL与ABA和PP2C磷酸酶效应物的结合，导致SnRK2激酶的失活。在胁迫下，ABA激活的SnRK2磷酸化TOR复合物的组分Raptor，引发TOR复合体解离和抑制。因此，TOR信号抑制ABA信号传导和应激反应，而ABA信号抑制TOR信号和应激时间的生长。植物利用这种保守的磷酸调节反馈机制来优化生长和胁迫反应的平衡。

5.逆境中心揭示植物病毒与宿主细胞间的博弈新机制（点击阅读）

1月23日，PNAS杂志在线发表了上海植物逆境生物学研究中心Rosa Loza-no-Duran研究组题为“A virus-targeted plant receptor-like kinase promotes cell-to-cell spread of RNAi" 的研究论文。该研究发现调控植物生长发育的受体蛋白BAM1可以促进细胞之间RNAi的扩散，揭示了BAM1在植物抗病毒免疫中的关键作用，也使利用生物技术编辑该蛋白以提高作物对病毒抗性提供可能。

（转化医学网360zhyx.com）