复旦团队研制出诱导型基因编辑ZFN靶向切除近10kb 全长HIV-1前病毒

近日，复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室朱焕章课题组设计并构建出只在HIV感染细胞上才能切除HIV-1前病毒的诱导型锌指蛋白核酸酶（ZFN-Tat），避免了ZFN持续表达可能引起的潜在脱靶效应，为该技术在临床上安全、有效地应用奠定了基础。相关研究结果近日发表在国际知名期刊《Molecular Therapy- Nucleic Acids》；论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S216225311830088X。

抗逆转录病毒治疗能显著改善艾滋病患者的生存率，但该疗法并不能治愈病人，其原因是抗病毒药物仅能抑制复制，并不能对感染细胞基因组中HIV前病毒起作用，即“治标不治本”。因此，如何靶向清除整合在免疫细胞基因组上的HIV前病毒，是目前艾滋病治疗研究领域最富有挑战性的科学问题；倘若能使整合的HIV前病毒从靶细胞基因组上缺失，那么，则可从根本上解决艾滋病不能治愈的问题，实现“斩草除根”的梦想。

目前，基于基因编辑技术的基因治疗大约有20 多个方案进入临床试验，效果令人鼓舞，但其安全性问题仍需要考虑，譬如脱靶效应和免疫原性。2017 年 5 月 30 日，《自然•方法》（Nature Methods）报道了来自哥伦比亚大学等机构的研究人员发现，在治愈小鼠相关疾病遗传性疾病的同时，基因编辑常用的工具 CRISPR/Cas9 可能会造成很多意料之外的基因突变。尽管，该文已撤稿，但技术本身的潜在脱靶效应是存在的。2018年1月，《自然》（Nature）报道了斯坦福大学Weinberg博士团队的一项新研究，发现七成的健康人体内存在Cas9蛋白同源物抗体，近半数人具有Cas9蛋白同源物的抗原特异性T细胞。人体会对Cas9酶产生免疫反应，意味着人体自身的免疫系统可能会破坏基于CRISPR-Cas9开发的基因疗法。Weinberg博士对此表示，Cas9只在短时间内开启或表达，或者可以将Cas9进行重新设计使其不会引起免疫反应或抑制免疫系统本身。因此，开发有效性与安全性于一体的基因编辑技术是临床应用的前提。

2013年，朱焕章教授课题组在国际上首次使用ZFN，成功切除了整合在基因组中的HIV-1前病毒。相关研究工作发表在了《Nucleic Acids Res》上，被《Nature Biotechnology》等著名杂志引用达到102次，是复旦大学2016年高被引文章之一。2017年，该技术已获得国内首个基因编辑技术在疾病上应用的授权专利（http://www.sohu.com/a/138447035_183834）。朱焕章教授课题组在此基础上，利用反式激活因子Tat可与HIV-1调控区LTR上反式激活应答元件TAR结合以促进病毒的转录和复制的原理，设计并构建了以HIV-1调控区LTR为启动子，通过反式激活因子Tat来调控ZFN的表达载体。由于Tat蛋白是HIV特有的病毒蛋白，仅在HIV-1病毒感染的细胞表达，而Tat蛋白可与调控载体ZFN 上游调控区 TAR元件结合，可诱导ZFN表达，从而导致ZFN介导前病毒基因切除 。伴随HIV-1前病毒的切除，Tat蛋白表达量将会减少，由此诱导的ZFN表达又恢复到背景水平，因而，可避免ZFN持续表达可能引起的潜在脱靶效应或免疫反应。将依赖Tat的ZFN表达载体转染HIV病毒感染细胞，结果显示大约30%感染细胞中HIV前病毒被切除（图1B）。若转染效率为100%的话，HIV前病毒被切除效率可达60%以上。

图 ZFN在HIV-1感染的细胞中依赖Tat诱导全长前病毒切除。左图为示意图，右图为ZFN表达载体转染HIV病毒感染细胞后流式细胞仪检测切除效率。

近几年来，朱焕章课题组在艾滋病基因治疗新型策略研究方面取得了阶段性进展。利用基因编辑三大技术，除了前述靶向切除HIV前病毒外，也获得了靶向抑制HIV或干预HIV潜伏的ZFP、TALE以及dCas9系统，证实了这些系统的有效性（Molecular Therapy, 2016, 508-521. Molecular Therapy- Nucleic Acids, 2017, 233-242）.Gene Therapy ，2014，90-95；AIDS Res Hum Retroviruses，2015，98-106）。