微滴式数字PCR(ddPCR)技术及应用

“预防就是治疗”--《众病之王：癌症传》

战胜癌症，早期预防、早期发现是关键。癌症患者如果在晚期被发现，90%的患者都会死亡，而肿瘤在早期发现，5年的存活率是90%。早期发现恶变细胞踪迹，可以通过干预手段，提高自身免疫力，也可以完整切除，结合化疗，治疗疾病。

微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。

可以对肿瘤早期进行筛查，项目可一次性检测与肿瘤发生发展密切相关的 9 个基因 48 个常见突变位点，覆盖常见恶性肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤、脑胶质瘤等。

只需抽取受检者 4ml 外周血，即可实现肿瘤早期无创检测。可以针对性的对高危人群、有肿瘤家族史易感人群、癌前病变人群、疑似肿瘤人群、癌症康复人群进行肿瘤筛查检测，从分子层面鉴定是否有基因突变，控制癌前病变。

DDPCR的原理是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

其灵敏度非常高，且只需要很少的模板量；尤其适用于痕量、不易得到的待检样品；弥补了第二代 PCR 系统难以精确测定基因拷贝数、无法对痕量突变定性和定量、精确度低等缺点。满足更多临床检验的需求，更精确，更数字化。非常适合一些稀有样本中核酸的精确检测，用于肿瘤的早期筛查、肿瘤继发性耐药检测及肿瘤负荷实时监控等。

微滴式数字PCR的技术优势

单分子分析：将微量临床样本再细分成 2 万个微滴，实现临床样本的“单分子分析”。

真正意义上的绝对定量，可统计突变率：无需标准曲线；检测下限可低至单拷贝；不依赖ct值，不依赖扩增效率，能克服 PCR 抑制剂的影响。

不再依赖Cq值或内参基因，即可确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。（Cq值：PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数）。

数据分析自动化：每个微滴的检测结果以阴性、阳性标示，由设备直接判断，通过把样本稀释成许多部分，然后在一个反应发生的时候对其计数。灵敏度可高达0.001%,显著高于扩增阻滞突变系统（0.1%）和sanger法测序（10%）。

克服了传统PCR系统高成本、通量有限、流程复杂、精确度低等缺点。

使用灵活：可按实验需要调整通量和灵敏度。

微滴式数字PCR的应用

定量癌症标志物

与野生型DNA的背景下，癌症相关突变因浓度低，往往逃过检测。微滴式数字PCR系统以其高灵敏度，能够轻松定量低至0.0001%的突变，这是其他方法无法做到的。

区分基因组变异

拷贝数变异（CNV）是人类基因组中个体差异的一个重要来源。CNV与癌症、神经和自身免疫疾病以及药物的不良反应存在关联。可靠地鉴定此类CNV，也代表了前沿研究中一种重要的能力。

研究病毒载量

在确定疾病状态和开发有效疗法时，精确地定量病毒载量至关重要。病毒库不断波动，有时会降至极低的水平。在研究许多不同的病原体时，成功和失败之间也许就一步之遥，那就是能够准确重复地测定病毒DNA或RNA。

之前，美国密西西比州一名出生时携带艾滋病毒的婴儿，经过抗逆转录病毒的治疗，已经被“功能性治愈”。在这个案例中，ddPCR平台发挥了重要的作用。研究人员表示，它通过将样品随机分布在上万个微滴中进行PCR扩增，从而确保了高度灵敏而准确的HIV DNA低拷贝分析。

新一代测序的验证

美国福瑞德•哈金森癌症研究中心的研究人员去年在《BioTechniques》杂志上发表文章，称ddPCR可作为一种精确的方法，用于NGS文库的质量控制。

在新一代测序的样品制备中，准确定量测序文库很关键，这可保证测序平台的高效利用。若测序运行时的文库分子过多或过少，都会使数据质量受损，有时甚至没有数据。这不仅浪费宝贵的样品和试剂，也浪费用户和仪器的时间。ddPCR系统可以融入NGS的文库制备流程中，精确定量测序文库。

基因表达分析

准确定量样品中存在的RNA转录本，有助于更好地了解基因表达和调控。ddPCR系统以其高灵敏度，特别适合发现和定量稀有转录本，让研究人员更深入地探究单细胞转录组学，并更好地了解RNA的实际功能。同时，其高精确度也使其能够检测样品之间基因表达的微小变化。

去年发表在《Nature Methods》上的一篇文章称，ddPCR技术能在不同情况下，准确重复地定量血浆和血清中的microRNA。作者认为ddPCR能帮助我们更加精确地追踪病人在治疗期间不同时间段中的血清microRNA浓度变化情况，这对于实时PCR来说，有时是不可能实现的。

总体来说，ddPCR的优点就是能够准确灵敏地检测出微量基因的变化及差异，提供给我们更可靠的数据，尤其是在临床医学研究领域其作用非常重要。第二届现代临床分子诊断研讨会特设了专题为“数字定量PCR技术进展、应用领域、趋势分析”的分论坛，欢迎各界朋友前来参会！

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