CRISPR/Cas9 的那些事

Part.1

CRISPR/Cas9技术到底是什么？

CRISPR/Cas9最初是在细菌体内发现，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。CRISPR全称为成簇的规律间隔的短回文重复序列，由众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区（spacer）组成，下图展示了完整的CRISPR序列位点结构。

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CRISPR的间隔序列可识别靶基因，重复序列转录出的crRNA和tracrRNA的融合体，即guide RNA(gRNA)可引导核酸酶Cas9对靶位点双链DNA进行切割。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（short guide RNA)，足以引导Cas9对任意DNA位点进行准确切割。

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3D动画带你了解CRISPR/Cas9基因编辑：

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CRISPR-Cas9技术在DNA编辑方面的简洁和高效使其迅速成为当前生命科学最为炙手可热的领域之一，已广泛应用于多种模式生物包括酵母、斑马鱼、果蝇、线虫、小鼠、恒河猴等的基因组改造。CRISPR-Cas9技术应用领域包括细胞和动物模型建立、功能基因组筛选、基因转录调节表观调控、细胞基因组活性成像和靶向治疗等。

Part.2

CRISPR/Cas9技术获得的荣誉

• 2013年,《Science》杂志列为年度十大科技进展之一。

• 2015年,Science十大科学突破榜单。

• 2015年,生命科学突破奖。授予6位科学家（每位获奖者300万美元）,其中杜德娜(JenniferDoudna)和卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)在“具有潜在革命性DNA编辑工具——CRISPR-Cas9技术”发明中做出重要贡献。

• 2016年,“小诺贝尔奖”——加拿大盖尔德纳奖。包括华裔科学家张锋在内的5名基因编辑技术“先锋”被授予国际奖。

• 2017年,“阿尔伯尼奖”。该奖项是全球生物医学领域最知名、最具影响力的奖项之一,被视为“诺贝尔奖风向标”。

  
  

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张峰，出生于河北石家庄、10岁移民美国，现为麻省理工学院最年轻的华人终身教授，他在CRISPR系统用于真核细胞（包括人类细胞）的基因编辑工具开发方面，做出了最前沿的探索。

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意外的是，王力宏也曾在微博中力挺张峰的CRISPR技术！这位音乐小天才不愧被称为“科普王”。

Part.3

CRISPR-Cas9面临的挑战

01

CRISPR编辑成功或增加患癌风险

2018年6月11日，顶级学术期刊《自然》（Nature）子刊《自然-医学》（Nature Medicine） 同时发表了两篇新成果，来自瑞典卡洛林斯卡研究所和剑桥诺华生物医学研究院的两个研究团队均认为，CRISPR/Cas9 基因编辑过程中造成DNA双链断裂，会激活p53蛋白通路，引起人多能干细胞的凋亡。反过来也就是说，经基因编辑后还能存活下来的细胞，通常存在p53功能缺陷。

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这两篇文章的发布，引起CRISPR相关公司的股价大跌！

02

脱靶效应仍需谨慎

有文献报道，CRISPR/Cas9的切割是通过gRNA与基因组位置之间20bp碱基的配对，且配对碱基的 5′ 端需要有PAM结构，再引导Cas9作用实现的，但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不明显，这项研究直接说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性。

2017年，Nature Methods杂志上发表的研究“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo”通过全基因组测序分析表明CRISPR基因编辑会引入数百种不可预估的突变到基因组中，文章所指出的大规模脱靶问题，对CRISPR的应用提出了尖锐的挑战，然而该篇文章在今年出现反转并进行了撤稿处理。但这篇文章在研究者们内部也有巨大分歧，包括通讯作者Alexander G Bassuk以及Vinit B Mahajan在内的其余四位作者则不同意撤稿。

从这些充满争议性的研究可以看出，在应用CRISPR/Cas9技术时，其脱靶效应仍需谨慎考虑。

03

CRISPR会造成编辑位点附近出现大量DNA缺失和重排

2018年7月16日，英国Wellcome Sanger研究所的科学家在Nature Biotechnology发文指出：CRISPR会造成编辑位点附近出现大量DNA缺失和重排。科学家们通常利用CRISPR产生微小的缺失，希望能够破坏基因的功能。遗憾的是，当Allan Bradley团队检查CRISPR编辑结果时，他们发现了大量的缺失——通常有几千个碱基那么长，此外还有复杂的DNA重排——原本相距甚远的DNA被连接在一起。

图片来源 Nature Biotechnology

这些“缺陷”容易干扰实验结果，从而增加基于CRISPR治疗的复杂化，引发科研人员对CRISPR准确性的质疑。

虽然CRISPR技术从2012年诞生以来已经对基础科研领域产生了革命性的影响，但是想要将其应用于疾病的治疗，其实还有非常长的路要走。（转化医学网360zhyx.com）