上皮样纤维组织细胞瘤:23例ALK融合伴侣的分子特征

摘要：上皮样纤维组织细胞瘤是一种罕见且独特的皮肤肿瘤。大多数病例具有ALK重排和ALK过度表达，该特征可使上皮样纤维组织细胞瘤区别于普通性皮肤纤维组织细胞瘤及其变型。以前在1例上皮样纤维组织细胞瘤中发现SQSTM1和VCL与ALK具有伴侣关系。本研究的目的是通过二代测序技术检测大样本上皮样纤维组织细胞瘤，从而明确ALK融合伴侣的性质和频率。回顾性复习2012–2016间诊断的上皮样纤维组织细胞瘤的病例。应用免疫组化证实ALK的表达。应用靶向二代测序对福尔马林固定，石蜡包埋组织中提取的RNA进行检测并确定融合伴侣。23例符合纳入标准。患者平均年龄39岁（8-74岁），无性别偏倚，>75%的病例累及下肢。最常见的基因融合为SQSTM1-ALK (N=12；52%）和VCL-ALK（N＝7；30%）；其他四例具有新的融合伴侣（DCTN1、ETV6、PPFIBP1和SPECC1L）。ALK免疫反应的模式通常是细胞质颗粒状染色（N＝12；52%）或颗粒状细胞质和细胞核染色（N＝10；43%）；含有ETV6融合伴侣的病例仅显示核染色。肿瘤形态与ALK融合伴侣间无明显关系。总之，SQSTM1和VCL是上皮样纤维组织细胞瘤中最常见的ALK融合伴侣；DCTN1、ETV6、PPFIBP1和SPECC1L是罕见的融合伴侣。这些基因编码的蛋白质在细胞骨架、细胞粘附、信号转导和转录等方面起着多样的作用，但缺少明显的共性。这些发现扩大了许多ALK融合基因的致癌混杂性，导致了具有广泛可变临床行为的不同谱系的肿瘤形成。这是首次ETV6-ALK和SPECC1L-ALK易位在肿瘤中的文献记载。

   前言

  上皮样纤维组织细胞瘤，也被称为上皮样细胞组织细胞瘤，是一种罕见的和令人困惑的皮肤肿瘤。临床上，该病变常类似于化脓性肉芽肿。肿瘤通常体积小，孤立；发病年龄广，主要在30-70岁之间；四肢是最常见的受累部位。形态学上，上皮样纤维组织细胞瘤常是外生性的，伴表皮围绕。肿瘤位于真皮中央，由肥胖的上皮样细胞组成，偶尔有梭形细胞成分。细胞核呈圆形到卵圆形，轻度非典型性，染色质空泡状和散在分布的双核和三核；核分裂像通常很少。

  最初该肿瘤被认为是纤维组织细胞瘤的一个亚型，1随后的研究发现二者在形态学和免疫组化上存在差异，对这一概念提出了挑战。大多数上皮样纤维组织细胞瘤中具有典型的ALK易位，这一发现最终证实了生物学上的差异。最近使用二代测序技术在2例病例中确定了VCL和SQSTM1是ALK的独特融合伴侣。VCL-ALK重排以前在一组独特的儿童肾细胞癌中报道， 而SQSTM1-ALK在ALK阳性的大B细胞淋巴瘤中被鉴定。已有多种肿瘤被报道含有ALK融合产物，包括炎性肌纤维母细胞瘤、淋巴瘤（如ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤和ALK阳性大B细胞淋巴瘤）、 肺腺癌、肾细胞癌、甲状腺癌、Spitz肿瘤。ALK有可能与许多伴侣基因融合，不同的肿瘤类型（伴有广泛变化的临床行为）可能具有完全相同的融合伴侣。考虑到ALK融合伴侣之间重叠的巨大可能性，本研究的目的是在一个大宗上皮样纤维组织细胞瘤的病例中来确定ALK产物在该肿瘤中的性质和发病程度。

  材料与方法

  在机构研究伦理委员会批准后，我们对2012至2016年间诊断为上皮样纤维组织细胞瘤的病例进行了回顾性复习。对每个病例进行复查，以证实诊断。ALK免疫组化根据以前的报道来确认ALK的表达。本研究的目的是确定ALK伴侣基因，因此，缺乏ALK免疫表达的上皮样纤维组织细胞瘤病例不包括在内。记录ALK染色的模式（即亚细胞定位）。

  每个病例通过靶向二代测序融合板进行检测。简单地说，对于每个病例，从福尔马林固定的石蜡包埋组织切下的4至5个4μm厚的未染色切片，将组织刮入Eppendorf 管中。使用ExpressArt FFPE Clear RNA Ready 试剂盒(Amsbio, Cambridge, MA)提取RNA。使用20-100ng总RNA与一种针对507个已知的融合相关基因的TruSight RNA融合板（(Illumina, San Diego, CA）制备RNA-seq文库。每一个样品加在有8个泳道的flow cell上，在Illumina MiSeq （每个样品~300万个读数）上用76个碱基对双端测序读取。使用the STAR aligner ， Manta fusion caller 和the JAFFA fusion caller utilizing BOWTIE2 aligner对结果进行分析。

  每个融合产物随后通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）独立地确定。简而言之，按照制造商的说明书（Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada），使用随机引物和莫洛尼式鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶对所提取的RNA进行RT-PCR。随后使用融合断点特异性的引物（补充表1）进行聚合酶链式反应（PCR）。采用HistalTaq DNA聚合酶（Qiagen, Toronto,Ontario, Canada），在94°C，30 sec，55°C，1 min和72°C,1 min的条件下进行40个循环的PCR。PCR产物在应用生物系统3730 DNA分析仪上使用 Big Dye Terminator v3.1 循环测序试剂盒（Applied Biosystems, Burlington, Ontario, Canada）进行测序。

  结果

  共有24例符合纳入标准。除一例未获得足够的RNA，其余23例获得足够的RNA并进行了分子诊断。临床上，患者平均年龄为39岁（范围：8-74岁），男女数量相当。大多数肿瘤位于下肢（78%），大腿（30%）是最常见的受累部位（表1）。

表1  上皮样纤维组织细胞瘤主要人口学、免疫组化和分子结果

  缩写：C，胞质；F，女性；M，男性；N，细胞核；NOS，非特殊性

  二代测序证实了ALK重排存在于所有肿瘤中（表1），其中SQSTM1为ALK的融合伴侣占12例（52%），7例（30%）VCL- ALK是融合产物。4例含有以前在上皮样纤维组织细胞瘤中未被报道的新的融合伴侣：DCTN1、ETV6、PPFIBP1和SPECC1L（图1）。所有融合分离点涉及ALK基因的外显子20（NCBI参考序列：NM_004304.4）。融合伴侣外显子为：SQSTM1外显子5（NM_003900.4）、VCL外显子16（NM_014000.2）、DCTN1外显子21（NM_023019.3）、ETV6外显子5（NM_001987.4）、PPFIBP1 外显子9（NM_003622.3）和SPECC1L外显子9（NM_015330.4）。每个融合产物通过RT-PCR和Sanger测序独立证实（图2）

图1饼图显示每一个ALK融合产物在研究队列中的的相对百分比。

图2 上皮样纤维组织细胞瘤中发现的每个ALK融合伴侣的Sanger测序的代表性图片： (a)SQSTM1-ALK,，(b) VCL-ALK，(c) DCTN1-ALK，(d) ETV6-ALK，(e) PPFIBP1-ALK ，(f) SPECC1L-ALK。星号表示分离点。

  免疫组化ALK表达模式如下：颗粒状细胞质染色（N＝12；52%），颗粒状细胞质和细胞核染色（N＝10；43%），仅核染色（N＝1；4%）。SQSTM1-ALK融合倾向于较常有颗粒状细胞质和细胞核染色（75%），而VCL-ALK融合通常有颗粒状细胞质染色而无核染色（86%）。在新的融合伴侣的病例中，ETV6 -ALK融合的肿瘤只显示核染色，而其余的病例显示颗粒状细胞质染色模式。

  形态学和其下的ALK融合伴侣之间没有明显的关联性。SQSTM1-ALK和VCL－ALK融合的肿瘤在形态学和免疫组化上类似于以前的报道（图3）。4例具有新的融合伴侣的病例均为息肉样；病例20、22和23含有表皮围绕。病例20（DCTN1-ALK）是溃疡伴混合性上皮样和梭形细胞形态学（图4）。ALK免疫组化表现为弥漫性颗粒状细胞质染色。病例21（ETV6 -ALK）通过Grenz带与表皮分隔，并有一些不规则性周围肿瘤边缘；这是唯一1例ALK显示明确的核染色病例（图4f）。病例22（PPFIPB1-ALK）和病例23（SPECC1L-ALK）均有颗粒状细胞质ALK表达（图5）。形态学上，后者的肿瘤细胞轻度少于其他肿瘤细胞，胶原性间质散布分布于肿瘤细胞之间（图5d和e）。

图3  含有以前报道的融合产物的上皮样纤维组织细胞瘤的的代表性照片：（a-c）SQSTM1-ALK 和（d-f）VCL-ALK 融合产物。注意：两种肿瘤内颗粒状细胞质ALK染色。（a和d）（HE×100）；（b和e）（HE×200）；（c和f）（ALK免疫组化×200）。

图4  伴有（a-c）DCTN1-ALK和（d-f）ETV6-ALK融合产物的上皮样纤维组织细胞瘤的的代表性显微图片。注意：ETV6-ALK 易位的ALK免疫组化核染色。（a和d）（HE×100）；（b和e）（HE × 200）；（c和f） （ALK免疫组化×200）。

图5 伴有（a-c）PPFIBP1-ALK和（d-f）SPECC1L-ALK融合产物的上皮样纤维组织细胞瘤的的代表性显微图片。纤细的周围血管是大多数肿瘤中常见的表现。 注意：具有SPECC1L-ALK 易位的上皮样纤维组织细胞瘤中散在分布的胶原性间质。（a和d）（HE×100）；（b和e）（HE×200）；（c和f）（ALK免疫组化×200）。

   讨论

  上皮样纤维组织细胞瘤是一种具有特异形态学和免疫表型的良性皮肤肿瘤。ALK重排和伴随ALK蛋白过表达的存在，以前证实该肿瘤在生物学上不同于普通的纤维组织细胞瘤及其变型。然而，由于发病罕见，只有很少病例经过严格的分子检查。本研究的目的是研究ALK融合产物在上皮样纤维组织细胞瘤中的性质和广度。我们发现SQSTM1 L和VCL是最常见的ALK融合伙伴。此外，我们在这一罕见的肿瘤中报道了4个新的ALK伙侣：DCTN1，ETV6，PPFIBP1和SPECC1L。此外，这是首次肿瘤中包含ETV6-ALK 和SPECC1L-ALK 融合基因的文献报道。

  ALK（间变性淋巴瘤激酶；CD246）编码一种属于胰岛素受体超家族中的跨膜受体酪氨酸激酶。这个基因的改变-包括易位、突变、拷贝数变化和表达失调）和许多肿瘤类型有关（详细综述见他文）。一组异质性肿瘤-包括间叶、上皮、淋巴造血和黑素细胞系分化-均报道含有涉及ALK易位。尽管似乎是独立的个体发生，但在不同的肿瘤中共同具有许多ALK融合产物。例如，EML4-ALK易位发生于肺腺癌，炎性肌纤维母细胞瘤，ALK阳性的大B细胞淋巴瘤和肾细胞癌。在潜在的ALK融合伴侣中具有巨大的差异；来自于该结果的进一步可塑性发现其他酪氨酸激酶受体基因可替代ALK，从而产生一个潜在的惊人数量的融合基因排列。例如，在炎性肌纤维母细胞瘤中，TFG已被报道与ALK和ROS1形成伴侣。

  本研究证实SQSTM1-ALK是上皮样纤维组织细胞瘤中最常见的融合产物。SQSTM1编码sequestosome 1（P62），它是一种具有多种作用的支架蛋白，包括NFκB信号和泛素介导的自噬。该基因突变与多种疾病有关，包括骨佩吉特病和额颞叶变性。在这项研究中，SQSTM1-ALK融合存在于一半多的病例中。除了上皮样纤维组织细胞瘤外，SQSTM1-ALK融合还曾在ALK阳性的大B细胞淋巴瘤，肺腺癌，以及炎性肌纤维母细胞瘤中（Dickson，未发表的观察）。SQSTM1的非ALK融合伴侣也有报道，包括甲状腺乳头状癌中的NTRK330以及急性粒单核细胞白血病中的FGFR1。

  在本研究中，略近1/3的病例具有VCL-ALK 融合产物。VCL编码纽蛋白，这是一种连接胞外基质与肌动球蛋白细胞骨架的黏附蛋白。纽蛋白被认为在细胞迁移、细胞基质粘附和细胞--细胞连接中起着重要作用。这种基因的突变与扩张型心肌病有关。除了上皮样纤维组织细胞瘤外，VCL-ALK融合也见于一些镰状细胞特性相关的儿童肾细胞癌中。

  这是DCTN1-ALK在上皮样纤维组织细胞瘤中的首次报道。DCTN1编码动力激活蛋白亚基1，它是动力激活蛋白复合物中最大的亚基，可结合微管和胞质动力蛋白。动力激活蛋白是一种具有多种细胞功能的基于微管的生物马达，包括细胞分裂和胞浆内囊泡和细胞器运动。DCTN1-ALK 易位以前在Spitz肿瘤、胰腺导管癌、炎性肌纤维母细胞瘤和肺腺癌中均已被报道。

  ETV6（ETS变体6；TEL）编码一种ETS家族转录因子参与DNA和蛋白质结合，在发育、分化和细胞增殖中具有重要作用。该基因的突变与血小板减少症和血液系统恶性肿瘤有关。 该基因混杂，在肿瘤中能与许多其他基因形成融合伴侣。除血液肿瘤外，ETV6-NTRK3融合还报道于先天性/婴儿纤维肉瘤、先天性中胚叶肾瘤、胃肠道间质瘤、婴儿NTRK相关的间叶性肿瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、乳腺样分泌癌、分泌性乳腺癌、鼻腔鼻窦低级别肠型腺癌、 Spitz 肿瘤和放射相关的甲状腺癌50。 ETV6融合并不局限于NTRK3；事实上，仅在血液系统恶性肿瘤中就有大约30种不同的ETV6融合伙伴（详见综述）。据我们所知，这是第一个记载的携带ETV6-ALK融合产物的肿瘤。有趣的是，这种融合与ALK免疫反应的核表达相关，在这项研究中的其他肿瘤表现为颗粒状细胞质或颗粒状细胞质和核染色。ALK染色的不同模式已与特定的融合伴侣相关；这种表达模式对于具有ETV6-ALK融合产物的上皮样纤维组织细胞瘤病例是唯一的和/或普遍的仍有待确定。

  PPFIBP1编码PPFIA结合蛋白1（liprinβ1），一种白细胞共同抗原相关（LAR）蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白。这种蛋白被认为参与了细胞黏附、迁移和发育。PPFIBP1-ALK易位已在炎性肌纤维母细胞瘤中报道；这是PPFIBP1重排在上皮样纤维组织细胞瘤中的首次报道。PPFIBP1的非ALK融合伴侣也已被鉴定，包括Spitz 痣中的ROS1。SPECC1L（具有钙粘素同源和卷曲螺旋结构域1的精子抗原）编码一种细胞骨架交联蛋白，在细胞粘附、运动和分裂中起着重要的作用。这一基因突变与颅颌面发育异常有关。这是疾病中SPECC1L与ALK形成体细胞基因融合的首次报道。我们以前遇到了一例涉及SPEC1L-NTRK2融合产物的病例，这是1例具有明显黏液样间质的未分化梭形细胞肿瘤（Dickson，未发表的观察）。

  大约88%的上皮样纤维组织细胞瘤有ALK重排的证据。推测在某些病例中其他基因如ROS1可能替代ALK。从机制上说，它还没有完全解决为什么ALK在肿瘤中是如此容易地与其他伴侣基因易位。在一些易位相关的肉瘤如滑膜肉瘤中，多个伴侣的发生是伴侣基因存在序列同源性的结果，然而，这似乎不是上皮样纤维组织细胞瘤中ALK伴侣广度的原因。上皮样纤维组织细胞瘤和其他“ALK瘤”的分子特征需要进一步确定。

  总之，这些结果表明在上皮样纤维组织细胞瘤中，SQSTM1是最常见的ALK融合伴侣，其次是VCL。另外，我们在上皮样纤维组织细胞瘤中报告了4个新的ALK伴侣：DCTN1，ETV6，PPFIBP1和SPECC1L。据我们所知，这是首次ETV6-ALK和SPECC1L-ALK易位发生于肿瘤中的报道。推测将来还会发现其它的ALK融合伴侣；此外，虽然其他基因如ROS1可以替代ALK，某些前述基因在上皮样纤维组织细胞瘤和其他肿瘤中能够产生非ALK伴侣也是有可能的。虽然我们至少目前还没有好的替代术语，但这些数据额外支持上皮样纤维组织细胞瘤应与其他类型的皮肤纤维组织细胞瘤区分开来。

  原文出处：Dickson BC, Swanson D, Charames GS, et al. Epithelioid fibrous histiocytoma: molecular characterization of ALK fusion partners in 23 cases. Mod Pathol, 2018,31:753-762来源：张前 译，黄文斌 校